王 鈞 ,張浩萌,張文彤 ,樊朝陽,李 俠△
1.空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院(西安 710032);2.空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院(西安 710038);3.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥理系(西安710032)
腦卒中是我國第一位死因,腦缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury, I/R)是卒中后腦損傷的重要因素,而氧化應(yīng)激(Oxidative stress, OS)是I/R的關(guān)鍵機制[1]。核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf 2)控制多種抗氧化反應(yīng)原件(Antioxidant response element, ARE),在內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)中扮演關(guān)鍵角色,并通過與ARE的相互作用調(diào)控I/R中的氧化應(yīng)激水平,進而決定損傷細胞的轉(zhuǎn)歸[2-3]。
雙香豆素類化合物在臨床上應(yīng)用廣泛,該類化合物可有效改善神經(jīng)系統(tǒng)微循環(huán)、清除自由基、減輕有害物質(zhì)聚集,進一步保護神經(jīng)細胞[4-5]。我們前期研究合成了新型雙香豆素類化合物3-CF3-4-CL,初步發(fā)現(xiàn)其具有增強神經(jīng)細胞抗氧化酶活性,清除氧化應(yīng)激產(chǎn)物的作用。本研究中,擬建立神經(jīng)元氧糖剝奪(Oxygen glucose deprivation, OGD)模型,以模擬動物水平I/R損傷,檢測新型雙香豆素類化合物3-CF3-4-CL對神經(jīng)元生存率、抗氧化酶的mRNA表達、抗氧化酶活性和蛋白水平的影響,明確該藥物對OGD損傷神經(jīng)元的作用和機制,為發(fā)現(xiàn)I/R新機制和新型防治方法提供實驗基礎(chǔ)。
1 實驗動物 無特定病原體(Specific pathogen free, SPF)級別健康C57BL/6孕鼠,孕14d;由空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。
2 受試藥物 3,3′-(3-三氟甲基-4-氯苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素(3-CF3-4-CL)。紅外光譜、核磁共振氫譜、高分辨質(zhì)譜等手段對該新型香豆素類化合物進行分子量、結(jié)構(gòu)和純度鑒定,結(jié)果提示化合物的m/z值與化合物元素組成質(zhì)量數(shù)計算值一致,純度達99 %以上。
3 皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng) 大腦皮層神經(jīng)元取自14d齡的C57BL/6胎鼠,顯微操作取胎鼠腦組織,剔除腦膜和微血管,小心分離皮質(zhì),剪碎,0.25 %胰酶消化15 min,后接種于經(jīng)多聚賴氨酸(Poly-L-Lysine,PLL)包被內(nèi)含10 %胎牛血清的杜爾伯科改良伊格爾(Dulbecco's modified eagle medium , DMEM)培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)板中,接種密度約2500/mm2。次日換含2 % B 27的Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng),之后每3天半量換液,繼續(xù)37 ℃、5 %CO2+ 95 %O2條件培養(yǎng)。
6 q-PCR 用Trizol法提取神經(jīng)元總RNA,試劑盒逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng);所得cDNA 以焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate,DEPC)水3倍稀釋,用于實時定量熒光PCR反應(yīng);并使用β-actin作內(nèi)在參照基因;得到ΔCT值用來比較給藥前后mRNA相對表達量的變化。所用PCR反應(yīng)設(shè)4個復(fù)孔。Nrf 2引物序列為上游CTTTAGTCAGCGACAGAAGGAC;下游AGGCATCTTGTTTGGGAATGTG;擴增長度:227。血紅素氧合酶-1(Heme oxygenase-1, HO-1)的引物序列為上游AGGTACACATCCAAGCCGAGA;下游CATCACCAGCTTAAAGCCTTCT;擴增長度:86。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)的引物序列為上游GGTGGGCCAAAGGATGAAGAG;下游:CCACAAGCCAAACGACTTCC;擴增長度:227。另一抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)的引物序列為上游:CAGTCGGTGTATGCCTTCTCG;下游:GAGGGACGCCACATTCTCG;擴增長度為:105。β-actin引物序列上游:GTGACGTTGACATCCGTAAAGA;下游:GCCGGACTCATCGTACTCC;擴增長度為245。
8 Western blot 總蛋白用蛋白裂解液提取,核蛋白、漿蛋白按試劑盒步驟提取。各組蛋白上樣量經(jīng)蛋白定量后分別上樣。經(jīng)過12 %十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠 (Sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel, SDS- PAGE) 電泳分離,濕法轉(zhuǎn)印轉(zhuǎn)后將聚偏氟乙烯 (Polyvinylidene fluoride,PVDF) 膜放入5 %脫脂牛奶室溫封閉2 h,使用Nrf 2抗體(1∶500)、HO-1抗體(1∶500)、β-actin抗體(1∶1000)和Histone H3抗體(1∶1000),4 ℃孵育過夜,后加入適當比例稀釋的辣根過氧化物酶標記IgG二抗(1∶2000)室溫孵育2 h,洗膜緩沖液(Tris buffered saline tween,TBST)漂洗膜3次,每次10 min,加入電化學(xué)發(fā)光(Electro chemi luminescence, ECL)液,發(fā)光成像。Quantity One軟件進行光密度分析。目的蛋白的相對表達量為目的條帶與對應(yīng)內(nèi)參β-actin(或Histone H3)的光密度比值。
1 神經(jīng)元形態(tài)變化 原代神經(jīng)元在接種于細胞培養(yǎng)板后,第1天觀察到細胞穩(wěn)定貼壁,并有突觸形成;第3天神經(jīng)元突觸增多、延長,胞體均勻,胞質(zhì)飽滿;第5天,神經(jīng)元突起增多并延伸,相互交織成網(wǎng)狀,初步形成神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò);第7天,神經(jīng)元發(fā)育成熟,突觸交互成網(wǎng)明顯,最接近其體內(nèi)狀態(tài),可用于后續(xù)研究。
2 細胞穩(wěn)定性和細胞存活率 細胞穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明,與CTRL組相比,3-CF3-4-CL藥物濃度小于50 μg/ml時對神經(jīng)元無毒性作用(P<0.05)。在細胞存活率實驗中,結(jié)果表明在3-CF3-4-CL藥物濃度逐漸提升后,3-CF3-4-CL表現(xiàn)出對OGD損傷神經(jīng)元的保護性作用,并在20 μg/ml處保護性效果最佳(P<0.05)。證明3-CF3-4-CL藥物在其無毒性濃度區(qū)間內(nèi),表現(xiàn)出神經(jīng)保護作用,并在20 μg/ml濃度下保護性效果最佳,故以20 μg/ml作為后續(xù)實驗藥物濃度(圖1)。
物料成本是產(chǎn)品開發(fā)成本的重要組成部分,物料采購協(xié)同,是影響服裝產(chǎn)品開發(fā)效率的難題。通過PDM系統(tǒng)的實施,采購人員可以通過拍攝物料照片、輸入物料參數(shù)并上傳系統(tǒng),實現(xiàn)多部門協(xié)同共享物料數(shù)據(jù);倉管部門可以根據(jù)設(shè)計部門的進程與指令及時調(diào)整樣衣物料的倉儲狀況;PDM系統(tǒng)內(nèi)完成入庫信息采集、領(lǐng)用申請與出庫管理。通過系統(tǒng)集成全面開展物料管理,可以有效避免物料供應(yīng)延后、計劃外采購和重復(fù)采購等問題。
5 CCK-8檢測細胞穩(wěn)定性及存活率 神經(jīng)元以2500/mm2的密度接種于96孔板,每孔加培養(yǎng)液100 μl,生長至7d。細胞穩(wěn)定性實驗:取正常培養(yǎng)神經(jīng)元,以3-CF3-4-CL終質(zhì)量濃度為0、1、2.5、5、10、20、50、100 μg/ml的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h,后加入含10%細胞增殖試劑盒-8(CCK-8)溶液的Neurobasal培養(yǎng)基,37 ℃孵育2 h。細胞存活率實驗:OGD組進行OGD損傷6 h后,常規(guī)培養(yǎng)18 h;3-CF3-4-CL處理組OGD損傷6 h后,加入含3-CF3-4-CL 0、1、2.5、5、10、20、30、40、50 μg/ml培養(yǎng)液培養(yǎng)18 h;Control組未行OGD損傷,后各組均加入含10 %CCK-8溶液的Neurobasal培養(yǎng)基,37 ℃孵育2 h。每個濃度設(shè)置4個復(fù)孔,在450 nm處測定其吸光度。
烏蘭察布市地處內(nèi)蒙古自治區(qū)中部,2009年被國家食品藥品監(jiān)督管理局確定為“全國十個地級食品安全示范市”之一;2013年被中國城市競爭力研究會評為“中國十佳食品安全城市”;2014~2015年連續(xù)兩年被自治區(qū)食品安全委員會評為“食品藥品安全工作優(yōu)秀盟市”;2016年,被國務(wù)院食品安全委員會列為全國創(chuàng)建食品安全城市試點地區(qū)。
3 mRNA水平變化 q-PCR結(jié)果表明,與Control組相比神經(jīng)元內(nèi)Nrf 2、HO1 mRNA相對表達水平在OGD損傷后升高,在3-CF3-4-CL 20 μg/ml處理組其mRNA表達水平進一步升高(P<0.05);神經(jīng)元抗氧化酶SOD、GSH-Px的mRNA相對表達水平在OGD處理后有所下降,而在3-CF3-4-CL 20 μg/ml處理組神經(jīng)元抗氧化酶SOD、GSH-Px的mRNA表達量顯著升高(P<0.05,圖2)。
觀察組30例患者給予阿司匹林與氯吡格雷聯(lián)合治療,阿司匹林治療方法同對照組一致,同時給予患者氯吡格雷片(樂普藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),國藥準字:H20123115)口服,75 mg/次,1次/d,連續(xù)治療30 d。
7 氧化指標檢測 原代神經(jīng)元生長至7d,收集細胞,低溫高速離心,取上清液,分別檢測SOD、丙二醛(Malonaldehyde, MDA)、GSH-Px水平。
所有數(shù)據(jù)均采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行處理,其中計數(shù)資料用n(%)表示,采用χ2檢驗,計量資料用(±s)表示,采用t檢驗,等級資料采用秩和檢驗,若P<0.05,則表明患者差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
4 OGD模型及給藥方式 取生長至7d的原代皮層神經(jīng)元,將培養(yǎng)基換為Earle's平衡鹽(Earle's balanced salt solution, EBSS)培養(yǎng)基,在含95% N2和5% CO2的缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h,后將細胞取出缺氧箱,常規(guī)培養(yǎng)18 h用于后續(xù)實驗。3-CF3-4-CL溶解于0.1 %二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO),以適當濃度稀釋于Neurobasal培養(yǎng)基。
求助渠道暢通V4(78.7)中的二級指標面對面求助渠道暢通V41(77.9)、在線求助渠道暢通V42(78.4)分值均較低。在“以學(xué)生為中心”的課堂教學(xué)常態(tài)下,引導(dǎo)學(xué)生學(xué)會自學(xué)非常重要,但是由于學(xué)生的認知差異性,若在自學(xué)的過程中碰到的困惑無法及時得到解答,將極大地降低其自學(xué)的自信心和能動性,所以教師為其建立暢通的求助渠道是非常重要的。當前,該任課教師此項得分最低,需進行求助渠道的快速完善。如建立該門課程的微信群、QQ群等線上交流平臺,建立學(xué)生互助獎勵機制,分組時盡量考慮同寢室的一組,以便線下互助。
鑒于此,為有效提高建筑業(yè)創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展績效促進行業(yè)可持續(xù)發(fā)展,根據(jù)以上結(jié)論提出如下建議。首先是減少政府行政干預(yù),降低政府主導(dǎo)的輸入型TFP增長。其次是讓市場在建筑業(yè)創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展中發(fā)揮決定性作用,增強市場主導(dǎo)的持續(xù)地內(nèi)生型TFP增長。最后是以“放管服”改革等為抓手更好的發(fā)揮政府的作用,有效提高科技進步貢獻率,促使建筑業(yè)創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展新動能進一步發(fā)展。
A:3-CF3-4-CL神經(jīng)元細胞穩(wěn)定性實驗,與Control組比較(CTRL), aP<0.05;B:3-CF3-4-CL對神經(jīng)元的保護性作用,與OGD (group 0) 組比較,aP<0.05
圖13-CF3-4-CL對神經(jīng)元的穩(wěn)定性和保護性作用
A:Nrf 2;B:HO-1;C:SOD;D:GSH-Px。與Control組比較,a P<0.05;與OGD組比較,b P<0.05
4 氧化和抗氧化指標 OGD組與Control組相比較,抗氧化酶SOD與GSH-Px表達量下降,MDA表達量增加(P<0.05)。3-CF3-4-CL 20 μg/ml處理組與OGD組比較,抗氧化酶SOD和GSH-Px活性升高,MDA表達量降低(P<0.05,圖3)。
5 蛋白水平變化 Western blot顯示,神經(jīng)元中Nrf 2總白表達量在OGD損傷后與Control組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),而3-CF3-4-CL 20 μg/ml處理組Nrf 2總蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。HO-1蛋白水平在OGD后表達量升高,3-CF3-4-CL 20 μg/ml處理后其表達量進一步升高(P<0.05)。細胞漿Nrf 2蛋白表達量在OGD組下降,在3-CF3-4-CL處理組進一步下降(P<0.05),細胞核Nrf 2蛋白表達量與之相反,在OGD組升高,3-CF3-4-CL 20 μg/ml處理組進一步升高(P<0.05,圖4)。
A:MDA含量變化; B:SOD含量變化; C:GSH-Px含量變化。與Control組比較,a P<0.05;與OGD組比較,b P<0.05
上:免疫印跡法檢測蛋白表達;下: 蛋白條帶灰度分析。A:Nrf 2;B:HO-1;C:Cytoplasm Nrf 2;D:Nuclear Nrf 2。與Control組比較,aP<0.05;與OGD組比較,bP<0.05
圖43-CF3-4-CL對神經(jīng)元Nrf 2、HO1蛋白表達和Nrf 2核轉(zhuǎn)錄的影響
本研究通過C57BL/6小鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng),利用其培養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定可靠、給藥方式精準、效果直接的特點,來研究腦缺血再灌注損傷在細胞水平的變化。皮層神經(jīng)元是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的結(jié)構(gòu),改善腦缺血再灌注損傷,保護皮層神經(jīng)元是干預(yù)其預(yù)后最為關(guān)鍵的措施[6]。同時皮層神經(jīng)元也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對缺血最敏感的細胞之一,故利用神經(jīng)元糖氧剝奪模型已是目前公認研究腦缺血再灌注損傷在體外細胞水平各種病理生理過程的最佳手段[7-8]。
雙香豆素是一種天然存在的雜環(huán)化合物,在機體擁有抗氧化、抗高血壓、抗凝血、抗癌等多種生物學(xué)活性[9]。而雙香豆素類衍生物甚多,目前已報道的雙香豆素類衍生物數(shù)量已超過2000種,也有研究報導(dǎo)部分雙香豆素類化合物擁有顯著的神經(jīng)保護性作用,故以此為基礎(chǔ),深入研究其構(gòu)效關(guān)系,設(shè)計合成類似物,從中篩選出新型雙香豆素衍生物,開發(fā)出高效低毒的神經(jīng)保護藥物潛力巨大[10]。
Nrf 2是一種參與細胞病理生理過程的核轉(zhuǎn)錄因子,在對抗氧化應(yīng)激過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用[11]。當細胞處于氧化應(yīng)激條件時,細胞內(nèi)活性氧(Reactive oxy gen species,ROS)生成與降解之間的平衡被打破,胞內(nèi)RO-S過度堆積,透支了內(nèi)源性抗氧化活性物質(zhì),從而對細胞產(chǎn)生不可逆的損傷性作用[12]。細胞氧化應(yīng)激條件下,Nrf 2可發(fā)生結(jié)構(gòu)變化進入細胞核,在細胞核中Nrf 2與抗氧化反應(yīng)原件結(jié)合,通過一系列反應(yīng)活化Nrf 2/ARE抗氧化通路,同時在通路下游的抗氧化基因也隨之激活,如:HO-1、SOD和GSH-Px,它們都是受到Nrf 2/ARE信號通路調(diào)控的抗氧化酶,相互作用清除細胞過量產(chǎn)生的ROS,使細胞氧化還原狀態(tài)趨于平衡,緩解細胞氧化應(yīng)激損傷[13]。已有相關(guān)研究表明,激活Nrf 2/ARE通路在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮著神經(jīng)保護作用[14],因此以神經(jīng)元為研究目標,探討3-CF3-4-CL對神經(jīng)元糖氧剝奪模型的保護性作用,可為大腦缺血再灌注損傷提供一種新治療靶點和新思路。
本研究結(jié)果表明,小鼠皮層神經(jīng)元OGD損傷后,神經(jīng)元細胞穩(wěn)定性下降,在新型雙香豆素類化合物3-CF3-4-CL處理后細胞存活率增加,并在一定藥物濃度范圍內(nèi)其細胞存活率提升顯著。在3-CF3-4-CL處理后,神經(jīng)元Nrf 2、HO-1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高,其下游SOD、GSH-Px的mRNA表達也隨之增加。Nrf 2總蛋白在3-CF3-4-CL處理后表達量上調(diào),Nrf 2漿蛋白表達量減少、核蛋白表達量增多,提示Nrf 2蛋白進入細胞核,并與ARE相互作用啟動抗氧化調(diào)控程序。促進下游抗氧化調(diào)控基因HO-1的表達,并進一步激活抗氧化酶,即抗氧化酶SOD與GSH-PX活化程度加強,細胞內(nèi)抗氧化能力提升,清除細胞內(nèi)過度堆積的ROS,減少MDA含量,最終減輕了神經(jīng)元受到的氧化損傷,改善神經(jīng)元細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)。以上結(jié)果均提示由實驗室自主合成的新型雙香豆素類化合物3-CF3-4-CL對OGD損傷神經(jīng)元的保護作用顯著。這可為腦缺血再灌注損傷的治療提供了新干預(yù)手段與理論基礎(chǔ)。