趙俠勇,趙君杰,宋錦寧△,金 濤

1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(西安 710061)；2.陜西省安康市中心醫(yī)院麻醉科 (安康 725000);3.陜西省安康市中心醫(yī)院神經(jīng)外科 (安康 725000)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是神經(jīng)外科常見的急危重癥，發(fā)病率大約為10/10萬，發(fā)病后1個月病死率達(dá)45%，30%的存活患者存在嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙[1]。目前研究認(rèn)為，SAH后早期腦損傷(Early brain injury，EBI)是影響SAH預(yù)后的關(guān)鍵因素[2]。EBI可能的病理機(jī)制包括細(xì)胞代謝改變、離子失衡、氧化應(yīng)激、免疫炎癥等[3]，其中免疫炎癥在SAH后EBI中發(fā)揮重要作用[4]，但其具體機(jī)制尚未完全闡明。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，是免疫炎癥的主要參與細(xì)胞，在SAH后的病理生理演變過程中扮演重要角色。SAH可導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞大量激活，并釋放多種細(xì)胞因子，參與SAH后神經(jīng)元損傷。IL-10是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，參與調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，但I(xiàn)L-10在SAH中的作用機(jī)制尚不完全清楚[5]。本研究擬通過血管穿刺法建立大鼠SAH模型，立體定向側(cè)腦室穿刺給予IL-10，利用Western blotting，免疫組化、HE染色及尼氏染色等分子生物學(xué)方法，研究SAH后神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞病理改變及炎癥相關(guān)因子TNF-α、IL-1β等的變化，以期闡明IL-10在SAH后參與EBI的相關(guān)作用機(jī)制。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑 選擇相同遺傳背景的健康成年雄性SD大鼠48只，體重300～350g，在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境飼養(yǎng)(溫度22℃，24h晝夜循環(huán)光照，食水自由)，隨機(jī)分為假手術(shù)組(12只)，SAH 1 d組(12只)，SAH 3 d組(12只)，SAH 1 d+IL10組(12只)、SAH 3 d+IL-10組(12只)。本實(shí)驗(yàn)動物倫理經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物倫理委員會批準(zhǔn)。IL-10的濃度為100 ng/L，建模后30 min內(nèi)通過立體定向方法行側(cè)腦室注射5 μl。實(shí)驗(yàn)材料包括：Iba-1抗體(日本W(wǎng)ako公司)，IL-10抗體、TNF-α、IL-1β(英國abcam公司)，IL-10蛋白因子(美國Novus公司)，兔SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)，蛋白提取試劑盒(西安赫特)，HE染色試劑盒(武漢谷歌生物)、尼氏染色試劑盒(武漢谷歌生物)。

2 模型制作 SAH模型制作參考文獻(xiàn)中的大腦中動脈穿刺模型[6]，所有大鼠術(shù)前常規(guī)禁飲食6 h，用100 g/L的水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉。麻醉成功后將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺，頸部剃毛、消毒。頸部正中切開皮膚，鈍性分離，暴露左側(cè)頸總動脈主干及分叉，繼續(xù)向上分離暴露頸內(nèi)動脈和頸外動脈。動脈夾臨時阻斷頸總動脈和頸內(nèi)動脈，絲線結(jié)扎頸外動脈遠(yuǎn)端并離斷，將帶有刻度的直徑約0.265 mm的魚線從頸外動脈殘端置入頸內(nèi)動脈，去掉頸內(nèi)動脈夾，從分叉處插入深度約20 mm，直至有突破感后再進(jìn)線1～2 mm，維持15 s后將線抽出，結(jié)扎頸外動脈，去除所有動脈夾，縫合切口。

3 大鼠側(cè)腦室注射 造模后30 min內(nèi)，大鼠俯臥位置于臺面，將頭部固定于腦立體定位儀上。頭頂皮膚剃毛，消毒，于正中做一長約1 cm切口，暴露前囟，以前囟為0點(diǎn)尋找進(jìn)針點(diǎn)，其坐標(biāo)[7]為：前囟后0.8 mm，中線旁1.5 mm。用磨鉆磨開顱骨，暴露硬腦膜，注射針垂直插入約3.5 mm，緩慢注射藥物，持續(xù)約10 min，完成后注射針繼續(xù)停留5 min，然后拔出注射針，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮切口。SAH組給予相同劑量的生理鹽水。

4 取材及組織病理學(xué)染色 SAH后1 d、3 d，麻醉大鼠，每組6只大鼠使用250 ml生理鹽水灌注取腦，分離皮層，置于液氮中保存。每組另6只大鼠使用生理鹽水250 ml灌注后并使用250 ml 40 g/L的多聚甲醛固定，取腦，并將腦組織放置在40 g/L的多聚甲醛中繼續(xù)固定48 h，然后置于自來水中24 h，80%乙醇浸泡。常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚5 μm，60℃烤切片1 h，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，標(biāo)準(zhǔn)步驟行HE染色、尼氏染色，常規(guī)脫水、透明、封片。

5 免疫組織化學(xué)檢測 常規(guī)烤片、脫蠟、梯度乙醇水化；3%的H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶；0.01mol/L枸櫞酸緩沖液微波修復(fù)，自然冷卻至室溫；5%BSA封閉；滴加一抗IL-10(1∶400)、Iba-1(1∶400)；4 ℃過夜后，滴加二抗孵育，滴加SABC孵育，DAB顯色，自來水沖洗干凈；蘇木素復(fù)染；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片，鏡檢。免疫組織化學(xué)染色評分通過陽性細(xì)胞數(shù)評分與染色強(qiáng)度評分的乘積獲取[8]。陽性細(xì)胞數(shù)評分：無細(xì)胞染色計(jì)0分，1%～10%細(xì)胞數(shù)著色計(jì)1分，11%～50%細(xì)胞著色計(jì)2分，51%～80%細(xì)胞著色計(jì)3分，81%～100%細(xì)胞著色計(jì)4分。染色強(qiáng)度評分：無著色計(jì)0分，弱陽性計(jì)1分，中等強(qiáng)度陽性計(jì)2分，強(qiáng)陽性計(jì)3分。

6 Western blotting檢測 按蛋白質(zhì)提取試劑盒的說明書提取大鼠皮層總蛋白，按1∶4比例加入Loading buffer后煮沸，置于-20℃。上樣，按每孔5 μl加入蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，并在5%脫脂牛奶中封閉1 h，過夜孵育一抗IL-10(1∶1000)、TNFα(1∶1000)及IL-1β，然后TBST洗膜，室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜，ECL顯影，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照，Image J軟件進(jìn)行分析。

7 行為學(xué)評估 大鼠行為學(xué)評估按照NSS評分法[9]，共18分：正常，0分；輕度損傷1～6分；中度損傷7～12分；重度損傷13～18分。包括運(yùn)動、感覺、反射和平衡檢測，運(yùn)動檢測：提起鼠尾巴，前肢屈曲1分，后肢屈曲1分，頭擺動的角度在縱軸超過10° 1分，將大鼠置于地面，正常行走0分，不能直線行走1分，圍繞癱瘓側(cè)轉(zhuǎn)圈2分，倒向癱瘓側(cè)3分；感覺檢測：淺感覺障礙1分，本體感覺障礙1分；平衡木檢測：穩(wěn)定的姿勢保持平衡0分，抓握注平衡木1分，抱住平衡木且一只腳從平衡木掉下2分，抱住平衡木且兩只腳掉下來或在平衡木上旋轉(zhuǎn)(>60 s)3分，在平衡木上嘗試保持平衡但掉下來(>40 s)4分，在平衡木上嘗試保持平衡但掉下來(>20 s)5分，從平衡木上掉下來(<20 s)；反射缺陷及不正常運(yùn)動：耳郭反射1分，角膜反射1分，驚訝反射1分，癲癇、肌陣攣、肌張力不全1分。

結(jié) 果

1 SAH后大體標(biāo)本及組織形態(tài)學(xué)改變 通過穿刺頸內(nèi)動脈制作大鼠SAH模型，與假手術(shù)組相比，SAH模型組可見蛛網(wǎng)膜下腔有廣泛的出血，尤其是在Wills環(huán)附近出血明顯。HE染色顯示，假手術(shù)組皮層神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核呈藍(lán)色的球形，胞漿淡染。SAH 1 d后皮層結(jié)構(gòu)疏松液化、結(jié)構(gòu)紊亂，部分神經(jīng)元腫脹，核固縮、深染、偏移(圖1)。

圖1 假手術(shù)組與SAH組腦組織大體觀及皮層HE染色(100×=146 μm;200×=73 μm)

2 SAH后IL-10的表達(dá)變化 Western blotting及免疫組織化學(xué)染色顯示IL-10表達(dá)于正常腦組織中，SAH 1 d及SAH 3 d IL-10表達(dá)未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，IL-10主要表達(dá)于細(xì)胞漿和細(xì)胞核，染色陽性的細(xì)胞形態(tài)多樣，呈大球形及分支形(圖2)。

3 IL-10改善SAH后神經(jīng)功能缺損 神經(jīng)功能評估在處死大鼠前操作。SAH后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損，SAH 1 d組及SAH 3 d組神經(jīng)功能缺損得分分別為(15.00±0.58)分和(12.00±0.73)分，表明是SAH 1 d組損傷程度為重度損傷，SAH 3 d組為中度損傷。與SAH組相比，IL-10顯著緩解了神經(jīng)功能缺損，SAH 1 d+IL-10組和SAH 3 d+IL-10組神經(jīng)功能評分分別為(8.83±0.79)分和(6.50±0.56)分，分別較SAH 1 d組和SAH 3 d組有顯著的降低(P<0.0001和P<0.0001)(圖3)。

4 IL-10改善SAH 1 d病理改變 與假手術(shù)組相比，SAH 1 d組皮層組織結(jié)構(gòu)紊亂疏松，神經(jīng)元尼氏體消失，給予IL-10后，與SAH 1 d組相比，皮層結(jié)構(gòu)較為完整，神經(jīng)元、尼氏體結(jié)構(gòu)基本完整(圖4a)；與假手術(shù)組相比，SAH 1 d組結(jié)構(gòu)紊亂疏松液化，細(xì)胞形態(tài)變化，核固縮深染，給予IL-10后，與SAH 1 d組相比，結(jié)構(gòu)基本完整，細(xì)胞形態(tài)基本完整，核圓(圖4b)。

圖2SAH后IL-10表達(dá)情況(a:WB檢測IL-10表達(dá)及灰度值分析;b:皮層IL-10免疫組織化學(xué)染色，比例尺100倍=50 μm，200倍=20 μm;c:IL-10免疫組化評分;ns：無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)

5 IL-10減輕SAH后炎癥反應(yīng) Western blotting顯示，與假手術(shù)組相比，SAH 1 d、SAH 3 d組TNF-α、IL-1β表達(dá)明顯升高(P<0.0001)。與SAH 1 d、SAH 3 d組相比，SAH 1 d+IL-10組、SAH 3 d+IL-10組TNF-α、IL-1β比相應(yīng)組表達(dá)明顯下降(圖5a、b、c)。與假手術(shù)組相比，SAH 1 d組小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量明顯增加、胞體變大、著色加深，小膠質(zhì)細(xì)胞由假手術(shù)組的多分支、細(xì)分支、小胞體變?yōu)榉种Т执?、分支減少、胞體增大。與SAH 1 d組相比，SAH 1 d+IL-10組小膠質(zhì)細(xì)胞明顯減小，分支多且細(xì)，著色減弱(圖6)。

討 論

本研究通過Western blotting及免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)正常腦組織中存在IL-10的表達(dá)，SAH后1d和3d的IL-10表達(dá)變化不顯著；但在SAH后1h內(nèi)，立體定向側(cè)腦室注射IL-10能明顯改善SAH后的神經(jīng)功能缺損，且通過HE染色及尼氏染色證實(shí)IL-10顯著緩解了SAH后的腦組織及神經(jīng)元損傷；進(jìn)一步通過蛋白定量檢測發(fā)現(xiàn)IL-10能降低SAH后腦組織中TNF-α、IL-1β的表達(dá)，并減少小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。因此，本研究結(jié)果提示IL-10可能通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)從而緩解SAH后神經(jīng)元損傷。

研究證實(shí)，針對SAH后腦血管痙攣的干預(yù)，即內(nèi)皮素-1受體拮抗劑并不能顯著改善SAH預(yù)后[10]。目前認(rèn)為EBI是導(dǎo)致SAH高致殘率和致死率的最主要原因，其中炎癥相關(guān)機(jī)制是導(dǎo)致SAH后EBI 的重要因素[11]。研究證實(shí)[4]，實(shí)驗(yàn)性SAH后小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多，TNF-α表達(dá)明顯升高，且與腦血流量的降低有一定相關(guān)性。Sozen等[12]研究發(fā)現(xiàn)，SAH后IL-1β表達(dá)明顯升高，認(rèn)為IL-1β在SAH后EBI中發(fā)揮重要作用。本研究證實(shí)，SAH后小膠質(zhì)細(xì)胞大量激活，炎癥因子TNF-α、IL-1β表達(dá)增高，佐證了SAH后炎癥反應(yīng)的存在。IL-10是人體內(nèi)重要的抗炎細(xì)胞因子，在急性腦損傷中發(fā)揮重要作用。有研究證實(shí)IL-10在大腦中動脈栓塞所致的缺血性卒中后表達(dá)上調(diào)[13]；而在IL-10缺陷的小鼠中，炎癥反應(yīng)加劇，卒中后梗死面積增大[14]。創(chuàng)傷性顱腦損傷后，IL-10 mRNA含量迅速升高，IL-10蛋白表達(dá)也在損傷后2 h升高，而局部給予IL-10后可減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活和TNF-α的釋放，還能減少損傷體積和腦水腫[15]；還有研究證實(shí)腦出血后IL-10表達(dá)亦可上調(diào)，而腦出血相關(guān)臨床研究表明，血漿中高水平的IL-10與血腫擴(kuò)張、再出血及不良預(yù)后有關(guān)[16]。

圖3 SAH后神經(jīng)功能缺陷評分

圖4 IL-10緩解SAH后皮層損傷(a：尼氏染色，b：HE染色，比例尺=73 μm)

圖5 IL-10減少SAH后TNF-α、IL-1β的表達(dá)

圖6 IL-10減少SAH后小膠質(zhì)細(xì)胞激活(比例尺=73 μm)

這些研究表明IL-10在急性腦損傷中的作用存在差異，在缺血性卒中和顱腦損傷中起到一定的保護(hù)作用，而在腦出血中提示不良預(yù)后。但相關(guān)研究表明SAH后基底動脈、腦脊液及大腦皮質(zhì)中IL-10 mRNA表達(dá)卻未見明顯變化[17]，SAH相關(guān)臨床研究中亦發(fā)現(xiàn)血漿和腦脊液中IL-10蛋白水平無明顯變化[18]，這些與本文研究結(jié)果一致。但I(xiàn)L-10在不同原因損傷后表達(dá)差異的機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步的研究。

IL-10是小膠質(zhì)細(xì)胞替代激活的一種標(biāo)記，參與抗炎作用，IL-10可能通過參與促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞的替代激活和誘導(dǎo)SOCS3從而緩解炎癥反應(yīng)。但SAH損傷后，腦組織中內(nèi)源性的IL-10表達(dá)未見明顯增高，可能未達(dá)到引起小膠質(zhì)細(xì)胞替代激活的水平[19]，因此SAH后炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，主要表現(xiàn)在小膠質(zhì)細(xì)胞的大量增生并釋放炎癥因子，如TNF-α、IL-1β等。SAH后早期經(jīng)側(cè)腦室注射IL-10后，可見小膠質(zhì)細(xì)胞活化減少，炎性因子釋放減少，且神經(jīng)元損傷程度的減輕，炎癥反應(yīng)表現(xiàn)明顯減弱，說明IL-10可能通過降低小膠質(zhì)細(xì)胞活化、減少炎癥因子釋放等途徑，改善SAH后EBI導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷及神經(jīng)功能障礙。

綜上所述，內(nèi)源性IL-10在SAH后表達(dá)未見明顯變化，給予外源性IL-10后可緩解SAH引起的炎癥反應(yīng)，并能減輕SAH后EBI導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷，改善神經(jīng)功能障礙，這為SAH后神經(jīng)損傷的抑制炎癥反應(yīng)治療提供了理論依據(jù)，仍需通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)炎癥機(jī)制在SAH后小膠質(zhì)細(xì)胞活化與神經(jīng)元損傷之間的作用機(jī)制。