白方會，李 慧，徐 茜，賈東佩，郭力碩，郭 躍，陳寶田，張保朝△

（1.南陽市中心醫(yī)院，河南 南陽 473000；2.廣州市紅十字會醫(yī)院，廣東 廣州 510220；3.南陽師范學(xué)院，河南 南陽 473000；4.南方醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510515）

偏頭痛以單側(cè)頭部反復(fù)發(fā)作的搏動性疼痛為特點。研究顯示我國偏頭痛女性年患病率較高（3.3%～32.6%）[1]。最新全球疾病負擔(dān)調(diào)查顯示偏頭痛患病率攀升至全球第6位，為第2位全球高致殘性疾病[2]。該病發(fā)病率高、治愈率低，目前缺乏安全有效的治療措施。P2X3受體作為偏頭痛的重要調(diào)節(jié)受體，本課題組前期就正天丸對P2X3受體在三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)表達的影響進行了研究[3-4]。中腦作為痛覺傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵部位，P2X3受體在此亦有表達。有研究報道在神經(jīng)病理痛模型中P2X3受體在中腦內(nèi)高表達起鎮(zhèn)痛作用，與其在外周神經(jīng)系統(tǒng)作用相反[5]。然而在中腦內(nèi)P2X3受體活化是否介導(dǎo)偏頭痛的發(fā)生尚不明確。本研究旨在探討P2X3受體在偏頭痛大鼠中腦內(nèi)表達變化及正天丸的抗偏頭痛作用是否影響了中腦P2X3受體的表達。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠24只，平均周齡（10.1±1.3）周。由鄭州大學(xué)實驗動物中心提供，飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度23～26℃，光暗周期12 h，相對濕度40%～60%，自由攝取食物和水，干預(yù)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。動物實驗遵循國家科技部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的要求[6]。正天丸（華潤三九，批號：1710005H），硝酸甘油注射液（益民藥業(yè)，批號：H11020289），熒光二抗-Cy3（凱基生物），P2X3 兔多克隆抗體（Santa Cruz），β-actin（中杉金橋），PVDF 膜（Millipore），ECL發(fā)光液和BCA試劑盒（碧云天），IS 2000 MM圖像工作站（Kodak）。

1.2 偏頭痛模型的建立 利用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為空白組、偏頭痛組、正天丸組，每組8只。正天丸組給予1.62 g/kg正天丸灌胃（藥量依成人每日口服劑量進行換算）；其余兩組給予生理鹽水1 mL灌胃，連續(xù)給藥7 d，末次灌胃30 min后大鼠頸背部皮下注射硝酸甘油（10 mg/kg），制造偏頭痛模型[7]，空白組皮下注射0.5 mL生理鹽水。

1.3 行為學(xué)觀察 以大鼠出現(xiàn)前肢頻繁撓頭、耳紅、煩躁不安等視為造模成功[8]。觀察指標(biāo)：①大鼠造模后耳紅出現(xiàn)和消失時間；②大鼠造模后撓頭開始和結(jié)束時間，以大鼠出現(xiàn)連續(xù)5次以上撓頭為撓頭開始時間，以30 min內(nèi)大鼠撓頭次數(shù)不足5次且表現(xiàn)蜷縮不動狀態(tài)為撓頭結(jié)束時間。

1.4 機械痛閾值的測定 用Von Frey纖維絲評定大鼠疼痛閾值。正式實驗前7 d，所有大鼠均行Von Frey纖維絲的適應(yīng)性檢測。進行實驗時，先將大鼠置于測試裝置內(nèi)適應(yīng)20 min，根據(jù)Dixon介紹的Up and Down法，用Von Frey纖維絲從2.0 g力度開始刺激大鼠須墊，以纖維絲彎曲成C型，刺激1～2 s，陽性反應(yīng)為大鼠縮頭、用爪撥開纖維絲和發(fā)聲等逃離反應(yīng)行為。當(dāng)該力度的刺激不能引起陽性反應(yīng)，則給予相鄰大一級力度的刺激；如出現(xiàn)陽性反應(yīng)，則給予相鄰小一級力度的刺激，當(dāng)出現(xiàn)第一次陽性和陰性反應(yīng)的騎跨，再連續(xù)測定5次，取其陽性數(shù)值的平均值即為疼痛閾值。檢測時間點為造模前0.5 h、造模后0.5 h、造模后 1.5 h、造模后 2.5 h。

1.5 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測

1.5.1 免疫熒光檢測 造模4 h后，10%水合氯醛麻醉后，4%多聚甲醛灌注固定，開顱取大腦，4%多聚甲醛固定24 h，脫水、石蠟包埋切片，片厚約10 μm。切片依次進行脫蠟、水化、熱抗原修復(fù)和滅活內(nèi)源性過氧化物酶后，BSA封閉后加入P2X3一抗（1∶500），4 ℃過夜，滴加 Cy3熒光二抗（1∶500），避光孵育1 h，倒置顯微鏡下觀察結(jié)果，顯現(xiàn)紅色為P2X3受體陽性，對照組以PBS作一抗。

1.5.2 Western blot檢測 造模4 h后各組取4只大鼠，麻醉后迅速冰上取材，裂解組織，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉1 h，TBST沖洗3次，加入一抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，羊抗兔二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光法進行曝光拍照，Molecular Imaging Software Version 4.0（Kodak）軟件分析條帶灰度值，每組重復(fù)檢測3次，以β-actin為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，組間比較用t檢驗或單因素方差分析，方差不齊時用Welch近似方差分析，組間多重比較，方差齊時用SNK-q檢驗，不齊時用Dunnett’s T3法，組內(nèi)比較用配對t檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)表現(xiàn) 偏頭痛組和正天丸組大鼠造模后均出現(xiàn)耳紅、頻繁撓頭及爬籠等表現(xiàn)，空白組大鼠表現(xiàn)不明顯，提示造模成功。2組大鼠耳紅出現(xiàn)時間和撓頭開始時間比較均無差異，均在造模后4 min左右開始；正天丸組耳紅持續(xù)時間和撓頭持續(xù)時間均較偏頭痛組縮短30 min左右（P<0.001），見表 1。

表1 各組大鼠耳紅及撓頭時間比較（±s，n=5，min）

表1 各組大鼠耳紅及撓頭時間比較（±s，n=5，min）

注：與偏頭痛組相比，*P<0.001

組別 只數(shù) 耳紅出現(xiàn)時間 耳紅消失時間 撓頭開始時間 撓頭結(jié)束時間偏頭痛組 5 4.08±0.79 134.92±7.25 4.42±1.08 136.50±5.96正天丸組 5 3.92±0.90 100.58±7.37* 4.17±0.83 101.17±5.41*t值 0.48 11.50 0.63 15.21 P值 0.64 0.000 0.53 0.000

2.2 各組大鼠疼痛閾值的變化 結(jié)果顯示，造模前各組大鼠基礎(chǔ)疼痛閾值無明顯差異，空白組除造模后0.5 h較造模前稍降低外（P=0.046），其余各時間點較造模前均無顯著差異；偏頭痛組各時間點疼痛閾值較造模前及同期空白組均明顯下降，再次證實已經(jīng)成功復(fù)制了偏頭痛模型；正天丸組造模后0.5 h疼痛閾值明顯下降，但隨后呈持續(xù)回升趨勢，造模后 1.5 h疼痛閾值（16.05±5.45）與空白組（31.72±9.72）相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。各組大鼠疼痛閾值比較見圖1。

圖1 各組大鼠疼痛閾值變化

2.3 P2X3受體在中腦內(nèi)的定位表達情況 免疫熒光結(jié)果顯示，P2X3受體在中腦內(nèi)多數(shù)神經(jīng)核團均有陽性表達，本文選取了具有典型定位意義的中腦導(dǎo)水管周圍的神經(jīng)核團。從圖2中可知，偏頭痛組呈明顯高表達狀態(tài)（圖中高亮的紅色熒光顆粒），正天丸組表達強度較偏頭痛組降低，空白組可見少量陽性表達。

2.4 中腦內(nèi) P2X3受體蛋白表達情況 Western blot結(jié)果顯示，P2X3/β-actin比值整體組間比較有顯著差異（F=178.51，P=0.000），組間兩兩比較顯示，3組之間均存在顯著差異（P=0.000），偏頭痛組（0.87±0.04），P2X3蛋白表達顯著高于其它2組，正天丸組（0.63±0.06）高于空白組（0.25±0.01），見圖 3。

3 討論

偏頭痛屬于中醫(yī)學(xué)“頭風(fēng)”“頭痛”“首風(fēng)”“腦風(fēng)”“偏頭風(fēng)”等范疇。偏頭痛多為本虛標(biāo)實之證，病位在腦髓經(jīng)絡(luò)，與肝、脾、腎三臟密切相關(guān)[9]。風(fēng)、瘀、濕、虛為偏頭痛的主要致病因素[10-12]。正天丸是全國名老中醫(yī)陳寶田教授創(chuàng)制的中成藥復(fù)合組方，由頭痛四大古方：川芎茶調(diào)散、麻黃附子細辛湯、桃紅四物湯、四藤消震飲化裁而來。正天丸綜合各方之精華，具有疏風(fēng)活血、通絡(luò)止痛、養(yǎng)血平肝等功效，為臨床治療偏頭痛的國家基本藥物，以其顯著的療效受到患者及醫(yī)務(wù)工作者的好評，并遠銷海外。本研究中通過對大鼠行為學(xué)觀察可知，成功復(fù)制了偏頭痛動物模型，而正天丸可以明顯縮短大鼠偏頭痛樣行為的持續(xù)時間，通過對大鼠面部疼痛閾值的測定雙重驗證了正天丸有明顯鎮(zhèn)痛作用。

圖2 各組大鼠中腦內(nèi)P2X3的表達（×100）

圖3 各組大鼠中腦P2X3受體蛋白的表達

P2X3受體屬于嘌呤能受體，介導(dǎo)痛覺過敏的形成與維持，參與了炎性痛、神經(jīng)病理性痛、癌痛、偏頭痛等多種急慢性疼痛的形成過程，目前已成為疼痛治療領(lǐng)域的新靶點[13-15]。

用于鎮(zhèn)痛的P2X3受體第二代拮抗劑已進入到臨床前研究階段[16]。P2X3受體選擇性高表達于處理痛覺信息的感覺神經(jīng)元上[17-18]。

中腦作為中樞內(nèi)源性疼痛調(diào)節(jié)系統(tǒng)的關(guān)鍵部位，P2X3受體也參與了中腦的疼痛調(diào)節(jié)過程，P2X3受體在正常大鼠中腦內(nèi)有少量分布[19]。有學(xué)者報道，在慢性坐骨神經(jīng)結(jié)扎所致神經(jīng)病理痛模型中P2X3受體在中腦內(nèi)高表達起到鎮(zhèn)痛作用，不同于其在外周神經(jīng)系統(tǒng)的致痛作用[5]。神經(jīng)病理痛是由于神經(jīng)系統(tǒng)（傳入神經(jīng)、脊髓或中樞神經(jīng)系統(tǒng)等）功能異?；蚪Y(jié)構(gòu)損傷所致的疼痛[20-21]，其發(fā)病機制與偏頭痛有所不同。那么在偏頭痛大鼠中腦內(nèi)P2X3受體起何作用，與本課題組前期研究結(jié)果，其在偏頭痛大鼠三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)高表達介導(dǎo)偏頭痛發(fā)生的作用是否一致？

本研究在正常大鼠中腦發(fā)現(xiàn)少數(shù)P2X3免疫陽性神經(jīng)元細胞，主要位于PAG外側(cè)區(qū)，與文獻報道一致，說明在生理狀態(tài)下中腦內(nèi)有少量P2X3受體表達。通過免疫熒光和western blot的雙重驗證，結(jié)果顯示偏頭痛組大鼠中腦內(nèi)P2X3受體表達明顯升高，正天丸組P2X3受體表達較偏頭痛組明顯降低，證明中腦內(nèi)P2X3受體的活化介導(dǎo)了偏頭痛的痛覺信息傳遞，與其在三叉神經(jīng)節(jié)、脊神經(jīng)節(jié)等周圍神經(jīng)系統(tǒng)所起作用一致。正天丸的抗偏頭痛作用與其可以抑制外周及中樞（中腦）神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)P2X3受體過表達有關(guān)，為其臨床療效奠定了有力的客觀依據(jù)。