陳權(quán)

摘 要：本文是《非洲豬瘟疫苗研發(fā)面臨的挑戰(zhàn)》的第三部分，主要討論非洲豬瘟滅活苗、亞單位疫苗以及異源非洲豬瘟病毒株的詳細(xì)情況。

關(guān)鍵詞：非洲豬瘟；保護(hù)性免疫；非洲豬瘟疫苗；保護(hù)性抗原

1 ASF滅活苗

至今為止，使用各種傳統(tǒng)的滅活疫苗來保護(hù)動(dòng)物免受ASF感染的嘗試均告失敗。未能提供保護(hù)作用的無效ASF滅活疫苗制劑的實(shí)例包括：滅活的受感染細(xì)胞的提取物、受感染豬外周血白細(xì)胞的上清液、純化并滅活的病毒粒子、受感染的用戊二醛固定的巨噬細(xì)胞和經(jīng)清洗劑處理的受感染的肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)物。最近一項(xiàng)使用滅活的ASFV和最先進(jìn)佐劑的研究也未能誘導(dǎo)接種疫苗的動(dòng)物產(chǎn)生保護(hù)性反應(yīng)?？紤]到現(xiàn)有的研究成果，開發(fā)有效的傳統(tǒng)ASF滅活疫苗似乎不太可能。

2 ASF亞單位疫苗——ASFV保護(hù)性抗原的鑒定

僅使用特定保護(hù)性病毒抗原和完美傳遞/載體系統(tǒng)的ASF亞單位疫苗可以改善傳統(tǒng)滅活疫苗的免疫效果。在設(shè)計(jì)亞單位疫苗策略和評(píng)估遞送/載體系統(tǒng)之前，我們需要了解相關(guān)的ASFV保護(hù)抗原及其自然抗原多樣性的范圍。Ruiz Gonzalvo等、Zsak等、Borca等和Gómez- Puertas等描述了直接針對(duì)三種病毒蛋白p30蛋白、p54蛋白和p72蛋白的ASFV中和抗體。另外，Gómez-Puertas等和Barderas等證明，宿主反應(yīng)（包括對(duì)p30蛋白和p54蛋白的中和抗體反應(yīng)）合起來可以對(duì)用ASFV歐洲毒株E75株攻毒的動(dòng)物提供一定程度的部分保護(hù)（約50%的存活率，幸存者有臨床癥狀，并可檢測到高滴度的病毒血癥）。同樣，用含有與泛激素結(jié)合起來的CD2v蛋白、p30蛋白和p54蛋白細(xì)胞外域的融合蛋白對(duì)豬進(jìn)行DNA免疫，可以保持十二分之三的免疫動(dòng)物免受ASFV歐洲分離株E75株的攻毒。值得注意的是，與上文討論的部分保護(hù)結(jié)果相反（即使動(dòng)物在攻擊感染時(shí)出現(xiàn)了高滴度的病毒中和抗體）。用表達(dá)p30蛋白、p54蛋白、p72蛋白和p22蛋白的桿狀病毒免疫豬并不能保護(hù)動(dòng)物免受一種毒性非洲豬瘟病毒的攻擊。

ASFV CD2v蛋白參與保護(hù)性免疫。CD2v蛋白（也稱為8DR蛋白或pEP402R蛋白）——一種參與協(xié)同調(diào)節(jié)細(xì)胞活化的T細(xì)胞蛋白——是唯一已知的細(xì)胞CD2的病毒同系物。CD2v蛋白是ASFV血凝素，對(duì)利用ASFV感染細(xì)胞介導(dǎo)血細(xì)胞吸附是必要的且有效的，CD2v基因缺失會(huì)減少病毒在豬體內(nèi)的復(fù)制和感染普遍化，并能夠在體外抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)。

用CD2v蛋白免疫的豬產(chǎn)生了血細(xì)胞吸附抑制（Hemadsorption Inhibiting，HAI）和可以識(shí)別出75 kDa病毒蛋白的單核細(xì)胞感染抑制（Monocyte Infection-Inhibiting，M-II）抗體，并且可以使用同源病毒株攻擊的動(dòng)物產(chǎn)生部分免疫。CD2v蛋白表達(dá)是特異性疫苗構(gòu)建所賦予的部分保護(hù)所必需的，并且據(jù)推測兩個(gè)預(yù)測的CD2v T細(xì)胞抗原表位會(huì)影響保護(hù)性免疫力。CD2v蛋白在保護(hù)性免疫上的其他支持來自使用ASFV嵌合病毒進(jìn)行的疫苗研究。在這里，同源CD2v蛋白[和相鄰的C型凝集素蛋白（EP153R）]是必要的，但不足以誘導(dǎo)動(dòng)物對(duì)ASFV感染產(chǎn)生保護(hù)性免疫力。

表明CD2v蛋白和/或C型凝集素在ASF保護(hù)性免疫上發(fā)揮重要作用的數(shù)據(jù)，似乎與弱毒化的非血細(xì)胞吸收型ASFV病毒（OURT88/3株和NHP68株）——可能缺失CD2v蛋白/C型凝集素蛋白（由于基因的N端截?cái)嗤蛔儯軌虮Ｗo(hù)豬免受強(qiáng)毒株攻擊的研究結(jié)果不一致。

這些研究結(jié)果之間的差異說明免疫接種攻毒試驗(yàn)設(shè)計(jì)和（或）ASFV攻毒株的毒力方面可能存在差異。

上述結(jié)果——在免疫動(dòng)物中只觀察到部分保護(hù)——表明，額外的ASFV蛋白參與誘導(dǎo)產(chǎn)生完整的宿主保護(hù)反應(yīng)。例如，用嵌合ASFV——其中只有CD2v蛋白和C型凝集素蛋白與攻毒毒株同源——可免疫但并不足以充分保護(hù)動(dòng)物，這表明針對(duì)其他病毒蛋白質(zhì)的宿主反應(yīng)可能是取得完全保護(hù)所需要的。同樣，Lacasta等證明，用缺乏CD2v基因、P54基因和P30基因序列的完整ASFV E75毒株（歐洲分離株）基因組表達(dá)文庫對(duì)動(dòng)物進(jìn)行DNA免疫接種將對(duì)其他病毒蛋白產(chǎn)生保護(hù)性免疫，因?yàn)?0%的免疫動(dòng)物受到了保護(hù)免遭E75毒株的攻擊。

盡管多個(gè)ASFV蛋白與免疫保護(hù)有關(guān)，但是研究表明尚無特定的病毒蛋白能有效地誘導(dǎo)豬產(chǎn)生強(qiáng)大的保護(hù)性免疫。這一失敗很可能表明，對(duì)多種病毒抗原（包括尚未鑒定的這些病毒抗原）做出反應(yīng)是取得完整的保護(hù)作用所需要的。或者，我們有必要改進(jìn)免疫策略，包括假定的ASFV保護(hù)性抗原的正確表達(dá)和編譯后的修飾、提供適當(dāng)?shù)目乖瓌┝亢驮谀M病毒感染的情況下向宿主提供正確的抗原，以便顯著提高迄今為止用特定ASFV蛋白獲得的保護(hù)結(jié)果。

3 什么是異源ASFV株

豬感染中等毒力或那些通過連續(xù)傳代而導(dǎo)致毒力減弱的ASFV毒株后，會(huì)對(duì)同源病毒的攻毒產(chǎn)生長期抗性，但很少對(duì)異源病毒的挑戰(zhàn)產(chǎn)生抗性。在交叉保護(hù)免疫的背景下，什么是異源ASFV毒株？了解在自然狀態(tài)下ASFV毒株的多樣性和毒株變種情況，尤其是有重大意義的保護(hù)性抗原的抗原多樣性，對(duì)于成功設(shè)計(jì)ASFV疫苗和開發(fā)能夠在病毒之間有差別對(duì)待，并能強(qiáng)有力預(yù)測針對(duì)任何ASFV田間分離株的特定疫苗有效性的快速診斷方法至關(guān)重要。目前的ASFV基因分型主要依賴于多個(gè)不同基因座序列的分析結(jié)果，這些基因座在不同的病毒分離株中表現(xiàn)出不同程度的變異性。標(biāo)準(zhǔn)的分型方法包括p72衣殼蛋白基因的分型，以提供廣泛的基因型間系統(tǒng)發(fā)生群，同時(shí)分析9RL/B602L基因中的中心可變區(qū)串聯(lián)重復(fù)（Central Variable Region Tandem Repeats），以在基因型內(nèi)解析（Intra-genotypic Resolution）。盡管研究人員洞察ASFV基因多樣性，但是基于p72衣殼蛋白基因的ASFV基因型與現(xiàn)有的交叉保護(hù)數(shù)據(jù)并不完全相關(guān)，并且在預(yù)測疫苗免疫效率方面可能價(jià)值有限。

盡管用于疾病診斷的ASFV血清學(xué)分析側(cè)重于保守的交叉反應(yīng)性病毒蛋白，但是有證據(jù)表明，基于HAI血清學(xué)分型，ASFV存在不同的抗原類型。此外，HAI分型將ASFV分為不連續(xù)血清群（Discrete Serogroups，SG），不一定通過常規(guī)p72衣殼蛋白基因分型來解決，因?yàn)檠褰M1、2和4的ASFV均具有p72基因型I。雖然研究人員已經(jīng)鑒定出8個(gè)ASFV-HAI血清組，不過可能存在更多的血清組。值得注意的是，現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明ASF保護(hù)性免疫力可能是SG特異性的，因?yàn)镾G內(nèi)的病毒相互間似乎存在交叉保護(hù)。

最近的數(shù)據(jù)表明，CD2v蛋白和C型凝集素蛋白對(duì)于介導(dǎo)HAI血清學(xué)特異性是必要的且有效的，并且通過SG-促進(jìn)研究毒株多樣性，CD2v/C型凝集素基因分型確實(shí)可對(duì)ASFV進(jìn)行分組。再加上上文將CD2v/C型凝集素作為ASFV保護(hù)性抗原的數(shù)據(jù)，這些支持了HAI血清型特異性保護(hù)性免疫的概念。同樣，其他病毒保護(hù)性抗原——可能也與血清群相關(guān)——可能是對(duì)取得完整的保護(hù)性免疫所必需的。

盡管在交叉保護(hù)免疫的背景下A SFv-HAI血清學(xué)分組和CD2v/C型凝集素基因分型似乎為研究ASF毒株變異提供了一種新的模式，但我們?nèi)孕柽M(jìn)一步研究以確定它們的穩(wěn)健性以及交叉保護(hù)性免疫的遺傳和抗原界限。

4 總結(jié)

在ASFV感染生物學(xué)狀況上取得的重大研究進(jìn)展為ASF疫苗的開發(fā)提供了新的機(jī)會(huì)。然而，在疫苗成為現(xiàn)實(shí)之前，重大的挑戰(zhàn)仍然存在。ASFV的比較基因組學(xué)和功能性基因組學(xué)研究已經(jīng)讓研究人員對(duì)病毒毒力和目前可以用來理性設(shè)計(jì)ASF LAV的宿主范圍有了深入的了解。剩下的挑戰(zhàn)是確定可以在不同的ASFV基因背景下起作用的減毒突變種的特定補(bǔ)體，以便在不損害免疫原性的前提下使疫苗的安全性最大化。在能夠設(shè)計(jì)ASF亞單位或DIVA兼容的載體疫苗策略和評(píng)價(jià)傳遞系統(tǒng)之前，我們需要了解ASFV的相關(guān)保護(hù)性抗原和病毒株的多樣性。盡管研究人員在這一領(lǐng)域已經(jīng)取得了進(jìn)展，但是當(dāng)務(wù)之急仍然是確定負(fù)責(zé)誘導(dǎo)豬產(chǎn)生完整保護(hù)性免疫反應(yīng)的ASFV蛋白。丘吉爾于1942年11月10日在倫敦Mansion House的演講中說的一句話能夠最恰當(dāng)?shù)乜偨Y(jié)ASF疫苗的前景：“這是結(jié)局，但不是開始的結(jié)局，而是結(jié)局的開始！”□□

原題名：Challenges for African swine fever vaccine development—“perhaps the end of the beginning”（英文）

原作者：D. L. Rock（美國伊利諾伊大學(xué)）