林興娥 ?？『? 陳瑩 明建鴻 高宏茂 葛宇 周兆禧

摘? 要? 本研究利用篩選出的10對多態(tài)性高、條帶清晰的SSR引物，以海南島68份紅毛丹種質為材料，進行遺傳多樣性分析和SSR指紋圖譜的構建。結果表明：10對引物在供試材料中共檢測出20個等位位點，多態(tài)性條帶比例為100%，平均多態(tài)性信息含量（PIC）為0.393;對68份紅毛丹種質做聚類分析，遺傳相似系數(shù)為0.290～0.664;采用引物-帶型組合法構建了68份紅毛丹種質的指紋圖譜。該結果為今后紅毛丹種質鑒定和分子育種提供重要依據(jù)。

關鍵詞? 紅毛丹;SSR;DNA指紋圖譜中圖分類號? S667.9? ? ? 文獻標識碼? A

Abstract? The SSR fingerprint map and genetic diversity of 68 rambutan （Nephelium lappaceum L.） accessions were studied using 10 pairs of selected polymorphic SSR primers. The results indicated that all the primers showed polymorphism， and 20 polymorphic alleles were revealed and the average polymorphic information content （PIC） was 0.393. The genetic similarities among accessions ranged from 0.290 to 0.664， on which a phylogenetic tree showing the relationship among the accessions was constructed. A strategy of combining primer pair with distinct alleles for fingerprint construction was developed and applied to the 68 cultivars. The DNA fingerprinting provides a technical reference for the varieties identification and molecular breeding in rambutan.

Keywords? Nephelium lappaceum L.; SSR; DNA fingerprint

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.013

紅毛丹（Nephelium lappaceum L.）為無患子科（Sapindaceae）韶子屬（Nephelium）熱帶多年生常綠喬木植物，起源于印度尼西亞和馬來半島，別名毛荔枝，與荔枝、龍眼同科。海南保亭熱帶作物研究所（以下簡稱保亭熱作所）自1960年從馬來西亞引進我國試種，并在此基礎上于20世紀80年代選育出適于海南省推廣種植的‘保研系列品系。早期對紅毛丹品系缺乏系統(tǒng)完善的鑒定方法，傳統(tǒng)的形態(tài)學特征鑒定易受環(huán)境條件影響，且資源圃內種植年限長，植株高大，掛果率低，以株型、葉型、果型等農(nóng)藝性狀和果實性狀為主的鑒定方法難以實行，致使品系混亂，限制了有針對性地開展本土化育種，嚴重制約了我國紅毛丹產(chǎn)業(yè)規(guī)?；?、可持續(xù)性發(fā)展。

與傳統(tǒng)的形態(tài)學標記方法相比，分子標記技術具有簡便、可靠、不受環(huán)境影響和多態(tài)性高等優(yōu)勢。已有國外研究報道分別應用RAPD[1-2]、AFLP[3]、ISSR和SRAP[4]等通用型的DNA分子標記技術，對部分紅毛丹品系開展了分子鑒定、種質資源評價等研究。但由于紅毛丹基因組及遺傳標記信息的匱乏，基于物種特異性分子標記（如SSR）的資源鑒定與評價尚未見報道。本研究在已完成紅毛丹Genome survey測序及全基因組范圍內開發(fā)SSR分子標記的基礎上，篩選出10對高多態(tài)性SSR引物，對在海南島收集并保存的68份紅毛丹種質資源進行遺傳多樣性分析，并開發(fā)了一種指紋圖譜構建方法，為紅毛丹種質資源的親緣關系分析、品種鑒定和分子育種等提供科學依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

66份紅毛丹材料采自保亭熱作所紅毛丹種質資源圃，2份材料采自儋州熱帶植物園，基本信息如表1所示，采集枝條上無病蟲害的新鮮幼嫩葉片，液氮速凍后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 方法

1.2.1? 紅毛丹基因組DNA的提取及質量檢測? 采用改良2×CTAB法[5]提取紅毛丹葉片基因組DNA。稱取幼嫩葉片0.2 g，加入0.03 g PVP和液氮磨成細粉，然后轉入2.0 mL預冷凍離心管中，再加入800 mL 65 ℃預熱的CTAB提取液[2%（m/V）CTAB，100 mmol/L Tris-HCl，20 mmol/ L EDTA，1.4 mol/L NaCl，2%（m/V）PVP，pH調至8.0]和20 μL b-巰基乙醇充分混勻，65 ℃溫浴30 min，期間輕搖2次;水浴完成后離心（15 ℃，12 000 r/min）15 min取上清液，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）抽提上清液，顛倒使之充分混勻，離心（4 ℃，12 000 r/min）15 min 取上清;再加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1）抽提1次，顛倒混勻，離心（4 ℃，12 000 r/min）15 min 取上清;加入等體積的異丙醇，混勻后可見絲狀或絮狀沉淀，即為DNA粗提物，用70%乙醇洗滌3遍，吹干;加入100 μL超純水溶解DNA，再加入0.5 μL RNase A液（10 mg/mL），37 ℃水浴消化30 min，最后用紫外分光光度法和1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測樣品DNA質量及完整性。根據(jù)檢測結果，將總DNA稀釋至20 ng/μL后，-20 ℃保存待用。

1.2.2? 分子標記分析? SSR引物均由深圳華大基因科技有限公司合成。從前期開發(fā)的紅毛丹SSR標記中隨機挑選出50對引物，以果皮顏色、果實大小和口感差異大的6份紅毛丹種質DNA（分別為BR2、BR5、R2、R10、R20、R60）為模板進行PCR擴增，最后篩選出10對擴增條帶清晰、多態(tài)性高且重復性好的引物（表2），SSR-PCR體系為20 μL，包括：30 ng DNA模板、0.2 mmol/L dNTPs、1.2 μmol/L引物，2.0 mmol/L MgCl2和2.0 U Taq DNA聚合酶。10×buffer、MgCl2、Taq DNA聚合酶均購自Thermo Fisher Scientific公司。SSR-PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，每個循環(huán)降1 ℃，72 ℃延伸1 min，共進行6個循環(huán);94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共進行25個循環(huán);72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，恒功率60 W電泳1 h，銀染顯帶。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)電泳結果，在凝膠相同遷移率位置上，有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，構成“0、1”序列數(shù)據(jù)陣，將圖形資料轉換為數(shù)字資料，采用Popgene 32軟件進行多態(tài)性與特異性分析，使用NTSYS 2.0軟件對種質進行UPGMA法聚類分析。DNA指紋圖譜構建采用英文字母與數(shù)字組合的方式[6-7]，其中英文字母按照多態(tài)引物字母編號依次排列，數(shù)字表示該分子標記在某樣品上擴增條帶的分子量，按分子量從大到小的順序進行記錄，同一引物擴增得到的不同條帶間用“-”連接數(shù)字，綜合不同引物的分析結果，串聯(lián)各帶型編號，形成該品種的SSR指紋圖譜。

2? 結果與分析

2.1? SSR標記多態(tài)性分析

對68份紅毛丹種質進行PCR擴增，共檢測到20條多態(tài)性片段，平均每個標記2條，多態(tài)性條帶比例為100%。由表3可知，20對SSR標記檢測到的有效等位基因（Ne）平均值為1.730，變幅為1.133（RamSSR25）～1.996（RamSSR19）;每個標記的多態(tài)性信息含量（PIC）平均值為0.393，變幅為0.365（RamSSR13）～0.498（RamSSR19），由此可見，各品系間多態(tài)性較低。

2.2? 指紋圖譜的構建

構建DNA指紋圖譜的基本原則是利用盡量少的標記區(qū)分盡量多的種質，以達到提高檢測效率、降低成本的目的。綜合考慮引物擴增的條帶數(shù)、穩(wěn)定性、條帶清晰度、PIC值等因素，最少用7對SSR引物（RamSSR12、RamSSR13、RamSSR19、RamSSR25、RamSSR30、RamSSR31、RamSSR33）就可將68份紅毛丹種質完全區(qū)分（表4，圖1）。其中，RamSSR13檢測效率最高，可鑒別28份紅毛丹種質。

2.3? 紅毛丹種質資源的聚類分析

對68份紅毛丹種質進行UPGMA法聚類分析，結果見圖2。各品系間遺傳相似系數(shù)平均值的變化范圍為0.290～0.664，最小值變化范圍為0～0.375，最大值的變化范圍為0.572～1.000（表5）。由此可見，68份紅毛丹種質間的平均遺傳相似系數(shù)較低，整體上遺傳多樣性不高，但各種質間也有很明顯的差異。ZWY2和BR2、R53，R24和R61遺傳相似性系數(shù)均為0，說明ZWY2和BR2、R53，R24和R61遺傳基礎差異最大，R32和R34遺傳相似系數(shù)為1，說明2個資源遺傳基礎相同，遺傳來源接近。68份種質的聚類結果顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.45處，所有品種可劃分為4個類群，BR2為黃果實生苗，遺傳基礎和其他種質不同，每個類群又被分為幾個亞群，總體遺傳相似程度高，遺傳多樣性相對較低。

3? 討論

隨著分子生物學和基因組測序技術的發(fā)展，越來越多的分子標記被開發(fā)應用于植物遺傳研究，SSR標記與ISSR、SRAP、RAPD等通用性分子標記相比，具有數(shù)量豐富、共顯性遺傳、多態(tài)性豐富等優(yōu)點，現(xiàn)已廣泛應用于果樹的品種鑒定、遺傳多樣性研究等領域。Anggraheni等[2]利用6個RAPD標記對9個紅毛丹品種進行了遺傳多樣性分析，多態(tài)性分析結果顯示，品種間的變異率為56%，PIC值為0.2～0.5。Kuswandi等[8]對收集到的33份紅毛丹及其近緣種質進行了形態(tài)學指標調查，并對其遺傳多樣性做了聚類分析，結果表明，紅毛丹及其近緣種分布在不同類群中，平均變異率約為55%。本研究中利用7對SSR引物對68份紅毛丹種質的聚類結果顯示，在遺傳相似系數(shù)為0.45處，所有種質可劃分為4個類群 ，每個類群又被分為幾個亞群（BR2為黃果實生苗，遺傳基礎和其他種質不同）。遺傳相似性分析顯示，68份紅毛丹種質之間遺傳相似系數(shù)平均值變幅為0.290～0.664，總體的遺傳相似性較小，遺傳基礎相對較窄。

DNA 指紋圖譜有助于快速、準確地鑒定品種真實性和純度，已廣泛應用于多種作物的遺傳育種和品種保護研究中。其中SSR標記具備可重復性好、操作簡便、共顯性等優(yōu)點，被認定是分子指紋圖譜構建的可靠標記類型之一。本研究采用SSR引物-帶型組合法構建的指紋圖譜，篩選出7對SSR引物（RamSSR12、RamSSR13、RamSSR19、RamSSR25、RamSSR30、RamSSR31、RamSSR33）PIC值范圍為0.362～0.498，平均PIC為0.399，略高于油菜（0.36）、花生（0.36）等作物指紋圖譜構建所用的核心引物的PIC值[9-10]，可將68份紅毛丹種質完全區(qū)分。隨著紅毛丹種質收集數(shù)量的不斷增加，需要不斷篩選、增加引物，擴充指紋圖譜數(shù)據(jù)庫;同時，還可將形態(tài)學鑒定、同工酶遺傳標記分析、染色體分析等技術結合起來，形成完整的紅毛丹指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，以保證指紋數(shù)據(jù)庫的實用性和準確度。

本研究選用紅毛丹種質資源大部分采自保亭熱作所紅毛丹種質資源圃，紅毛丹種質均于20世紀60年代引自馬來西亞等地區(qū)，由于年代久遠，早期引種記錄缺失，缺少配套栽培管理，導致紅毛丹資源圃現(xiàn)有種質管理混亂，遺傳基礎不清晰，遺傳多樣性低。目前生產(chǎn)上主要種植‘保研7號為主的‘保研系列品種，由馬來西亞種質選育，遺傳基礎相對狹窄，不僅果實商品類型不夠豐富，也限制了遺傳育種的潛力。因此，需要廣泛收集和鑒定紅毛丹種質資源，尤其是保護和挖掘本地的優(yōu)異野生資源與開展品種改良工作，是擴大生產(chǎn)、降低風險、提高品質、促進我國紅毛丹產(chǎn)業(yè)進一步發(fā)展的迫切需求。

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