徐小芳 梁趙良 曾睿智 呂曉丹 劉耿峰 呂小平

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院（南寧530021）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）主要分為潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩病（Crohn′s disease，CD）兩種類(lèi)型，其發(fā)病率在全球呈上升趨勢(shì)，我國(guó)的發(fā)病率也正逐年上升［1］。IBD的病因尚不明確［2］，普遍認(rèn)為是腸道的上皮細(xì)胞、共生的微生物群、黏膜免疫系統(tǒng)之間的三者關(guān)系失調(diào)導(dǎo)致慢性炎癥的發(fā)生，這三者又受到遺傳和環(huán)境因素的影響［3］。

目前已證實(shí)了200多個(gè)IBD易感性基因位點(diǎn)［4］，其中大多數(shù)是在基因編碼區(qū)。LIBIOULLE等［5］發(fā)現(xiàn)5p13.1 基因多態(tài)性與CD的易感性有關(guān)，它是一段1.25-MB的基因非編碼區(qū)，與CD 相關(guān)的遺傳變異能上調(diào)PTGER4的表達(dá)水平，其中rs4495224和rs7720838 基因多態(tài)性與CD 關(guān)系較強(qiáng)，對(duì)PTGER4表達(dá)的影響最為顯著，常將PTGER4基因作為CD的易感基因。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PTGER4與早發(fā)型UC易感性有關(guān)［6］。PTGER4基因可以編碼產(chǎn)生EP4亞基［7］，EP4 作為前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的受體與其結(jié)合導(dǎo)致了白細(xì)胞的募集和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，參與了腸道炎癥的發(fā)生和緩解作用［8］。近年來(lái)，非基因編碼區(qū)的疾病易感基因越來(lái)越受到關(guān)注，研究［9］表明非編碼RNA 在炎癥性腸病細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)起重要作用。目前該基因多態(tài)性與IBD的研究國(guó)內(nèi)外報(bào)道尚不一致，GLAS等［10］、PRAGE等［11］發(fā)現(xiàn)rs4495224和rs7720838 基因多態(tài)性與法國(guó)、比利時(shí)、德國(guó)、北美人群CD的易感性有關(guān)，與UC 無(wú)關(guān)。但在日本人群并未發(fā)現(xiàn)以上兩個(gè)位點(diǎn)與IBD 有關(guān)［12］。郭政等［13］通過(guò)Meta分析發(fā)現(xiàn)rs4495224 基因多態(tài)性與CD 無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。我國(guó)尚無(wú)該基因多態(tài)性與IBD 相關(guān)的臨床研究報(bào)道，廣西是我國(guó)壯族人口最大的聚居地，壯族、漢族人群擁有不同的疾病遺傳性［14］。本研究目的是探討PTGER4rs4495224和rs7720838 多態(tài)性與廣西壯族、漢族人群IBD 以及臨床特征的相關(guān)性，為IBD的基因診斷及治療提供線索。

1 資料和方法

1.1 臨床資料收集2014年5月至2018年11月在廣西醫(yī)科大學(xué)第一、第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科門(mén)診、住院的廣西區(qū)域無(wú)血緣關(guān)系的IBD 患者212例（UC 組：壯族59例，漢族69例；CD 組：壯族40例，漢族44例）。IBD的診斷符合2018年制定的《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)［15］，并排除患有其他自身免疫性疾病、感染性腸炎患者。另收集廣西區(qū)域無(wú)血緣關(guān)系的健康對(duì)照者190例（壯族90例，漢族100例）。納入對(duì)象為同期就診于廣西醫(yī)科大學(xué)第一、二附屬醫(yī)院，均已排除腫瘤、自身免疫性疾病及IBD 家族史的健康體檢者。IBD 組和正常對(duì)照組年齡及性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。標(biāo)本采集經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)和患者本人或家屬知情同意。

1.2 研究方法（1）DNA 提取：采用DNA 試劑盒提取腸黏膜DNA。（2）位點(diǎn)的選擇：從NCBI 獲取SNP 信息，選擇的SNP 最小等位基因頻率（MAF）＞15%，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，所選SNP 可能與CD的并發(fā)癥有關(guān)。（3）PCR 擴(kuò)增：①引物設(shè)計(jì)：根據(jù)NCBI 基因數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)rs4495224和rs7720838 位點(diǎn)引物，序列見(jiàn)表1。②PCR 反應(yīng)體系：DNA2 μL+上下游引物各1 μL + Master Mix 25 μL + RNase-free Water 21 μL。③反應(yīng)條件：變性94 ℃、30 s，退火50 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，共30個(gè)循環(huán)，72 ℃繼續(xù)延伸7 min。④基因測(cè)序：電泳鑒定目的片段，并將PCR產(chǎn)物送測(cè)序，用Chromas 軟件判讀基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。統(tǒng)計(jì)rs4495224和rs7720838 位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率，采用Hardy-Weinberg 遺傳平衡性檢驗(yàn)，P＞0.05 提示具有群體代表性。用χ2檢驗(yàn)或Fisher 確切概率法檢驗(yàn)比較組間各基因型和等位基因頻率以及分析基因多態(tài)性與臨床特征的差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2 結(jié)果

2.1 rs4495224 基因多態(tài)性分析結(jié)果PCR 產(chǎn)物電泳條帶與目的片段大小一致。測(cè)序結(jié)果與Gen-Bank 基因庫(kù)上序列一致。共得到3種基因型：野生型純合子CC 型、突變型雜合子AC 型和突變型純合子AA 型。

基因型及等位基因頻率分布見(jiàn)表2、3。各組基因型及等位頻率分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05），具有群體代表性。漢族CD 組突變基因型（AA+AC）頻率、A 突變等位基因頻率明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002；P=0.001）；壯族UC 組、CD 組、漢族UC 組分別與正常對(duì)照組比較、壯族CD 組與漢族CD 組比較、壯族CD 組與漢族CD 組比較基因型及等位基因頻率分布均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；進(jìn)一步分析rs4495224 多態(tài)性與漢族CD 臨床特征（病變部位、疾病活動(dòng)性、有無(wú)并發(fā)癥）的關(guān)系，CD 病變部位分為：回腸末段（L1）、結(jié)腸（L2）、回結(jié)腸（L3）；依據(jù)簡(jiǎn)化克羅恩活動(dòng)指數(shù)計(jì)算法將疾病活動(dòng)性分為：緩解期、活動(dòng)期；并發(fā)癥包括：瘺管、腹腔膿腫、腸腔狹窄和腸梗阻、肛周病變等［15］。在漢族CD的不同病變部位、疾病活動(dòng)性、有無(wú)并發(fā)癥其基因型和等位基因頻率的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 rs7720838 基因多態(tài)性分析結(jié)果PCR 產(chǎn)物電泳條帶與目的片段大小一致。測(cè)序結(jié)果與Gen-Bank 基因庫(kù)上序列一致。共得到3種基因型：野生型GG 型、雜合子突變TG 型和純合子突變TT 型。

基因型頻率及等位基因頻率分布見(jiàn)表4、5。各組基因型及等位頻率分布符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05），具有群體代表性。漢族CD組突變基因型（TT + TG）頻率、T等位基因頻率明顯高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015；P=0.006）；漢族CD 組T等位基因頻率（29.5%）高于壯族CD 組（15%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.028），二者的基因型頻率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。壯族UC 組、CD 組、漢族UC 組分別與正常組比較、壯族UC 組與漢族UC 比較基因型及等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在漢族CD 患者的不同病變部位、疾病活動(dòng)性、有無(wú)并發(fā)癥中基因型和等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 rs4495224 病例組與對(duì)照組基因型頻率和等位基因頻率Tab.2 rs4495224 genotype and allele frequency in case group and control group

表3 rs4495224 漢族CD 組基因-臨床特征分析Tab.3 rs4495224 gene-clinical characteristics analysis in Han CD group

3 討論

PTGER4基因編碼產(chǎn)生PGE2的受體EP4 亞基，其廣泛表達(dá)于骨髓、結(jié)腸、小腸、胃等組織。PGE2 是花生四烯酸（arachidonicacid，AA）以環(huán)氧合酶（COX）為限速酶而產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物之一，它通過(guò)與四種受體亞型（EP1-EP4）結(jié)合，參與急性炎癥和炎癥性免疫疾病的發(fā)生和發(fā)展［8］。既往研究發(fā)現(xiàn)PGE2的促炎作用主要通過(guò)EP1和EP3受體介導(dǎo)，EP4 通過(guò)激活抗凋亡和增殖信號(hào)通路，對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞的存活和再生有重要作用［16］，NAKASE等［17］發(fā)現(xiàn)EP4 激動(dòng)劑能抑制結(jié)腸炎發(fā)展并促進(jìn)粘膜愈合。但有研究發(fā)現(xiàn)，PGE 2 可以通過(guò)EP2/Ep4 受體增加IL-12和IFN-γ信號(hào)通路促進(jìn)Th1細(xì)胞分化；通過(guò)IL-1β和IL-23 通路促進(jìn)體外Th17細(xì)胞增殖［8］。既往研究報(bào)道Th1、Th17 這兩種輔助性T 細(xì)胞和IBD的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［18］。另外，GLAS等［10］發(fā)現(xiàn)核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）和X 盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）可能分別與5p13.1某基因組區(qū)域結(jié)合從而上調(diào)PTGER4表達(dá)進(jìn)而影響IBD的發(fā)病。其中轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 參與多種炎癥信號(hào)通路［19］，腸上皮細(xì)胞中XBP1的缺失導(dǎo)致自發(fā)性腸炎［20］，二者都參與IBD的發(fā)病。近年來(lái)PTGER4基因被發(fā)現(xiàn)與多種其他自身免疫性疾病有關(guān)，如強(qiáng)直性脊柱炎（rs7726237）［21］、多發(fā)性硬化癥（rs9292777）［22］、類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rs76523431）［23］等，其發(fā)病機(jī)制可能是PGE2 在體內(nèi)通過(guò)EP4 受體促進(jìn)輔助性T 細(xì)胞的功能，促發(fā)免疫炎癥的發(fā)生。研究［24］表明使用EP4 選擇性拮抗劑可減少局部淋巴結(jié)中Th1和Th17 細(xì)胞的積累，并抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎或接觸性過(guò)敏小鼠的疾病進(jìn)展。因此EP4 拮抗作用可能是治療難治性免疫疾病的良好藥物靶點(diǎn)。

表4 rs7720838 病例組與對(duì)照組基因型頻率和等位基因頻率Tab.4 rs7720838 gnotype and allele frequency in case group and control group

表5 rs7720838 漢族CD 組與基因-臨床特征分析Tab.5 rs7720838 gene-clinical characteristics analysis in Han CD group

本研究發(fā)現(xiàn)PTGER4基因rs4495224和rs7720838多態(tài)性與廣西漢族人群CD的易感性相關(guān)，但與壯族CD、漢族和壯族UC 無(wú)關(guān)。rs4495224 A和rs7720838 T 危險(xiǎn)等位基因可能增加漢族CD 人群PTGER4的表達(dá)，ER4 受體增加與PGE2 結(jié)合促進(jìn)Th1 細(xì)胞分化、Th17 細(xì)胞增殖，各種促炎因子如IFN-γ、TNF-α、IL-17等分泌增加參與CD的病理改變。本研究中漢族的研究結(jié)果與LIBIOULLE等［5］、GLAS等［10］、PRAGE等［11］的報(bào)道一致，但與日本人群的報(bào)道相悖。漢族與壯族CD 組的基因型和等位基因頻率對(duì)比，發(fā)現(xiàn)攜帶rs7720838 T等位基因的漢族人群患CD 風(fēng)險(xiǎn)比壯族高，但在rs4495224中并無(wú)此發(fā)現(xiàn)。中國(guó)是一個(gè)有56個(gè)民族的國(guó)家，相同種族不同民族IBD的發(fā)病率和患病率存在差異，唐源等［25］發(fā)現(xiàn)在云南省18個(gè)不同少數(shù)民族中，漢族人群的總患病率和UC 患病率均最高。本研究中漢族和壯族的結(jié)果不同可能是不同民族受個(gè)體遺傳背景影響，也可能與不同民族的經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平、居住環(huán)境和生活習(xí)慣不同有關(guān)。本研究基因-臨床特征分析顯示，rs4495224和rs7720838基因多態(tài)性與廣西漢族CD的病變部位、疾病活動(dòng)度、有無(wú)并發(fā)癥無(wú)關(guān)聯(lián)，這一結(jié)果與GLAS等［10］、PRAGE等［11］關(guān)于基因-臨床特征、基因-基因的關(guān)系研究不一致。這些結(jié)論受到小樣本和地理區(qū)域的限制，還需要進(jìn)一步研究。本研究未發(fā)現(xiàn)rs4495224和rs7720838 與漢族UC 及壯族UC和CD發(fā)病相關(guān)，因此沒(méi)有進(jìn)一步研究基因多態(tài)性與臨床特征的關(guān)系。

綜上，PTGER4基因rs4495224和rs7720838 多態(tài)性可能與廣西漢族人群CD 易感性有關(guān)，可能與漢族CD的病變部位、疾病活動(dòng)性、有無(wú)并發(fā)癥無(wú)關(guān)，可能與漢族UC、壯族CD 及UC 易感性無(wú)關(guān)；攜帶rs7720838 T 突變等位基因的漢族人群患CD 風(fēng)險(xiǎn)可能比壯族高。然而本研究樣本量較少、所納入的臨床特征分組過(guò)少、漢族與壯族人群的結(jié)果不一致，尚不能得出可靠結(jié)論，還需更大規(guī)模的研究去證實(shí)；由于CD 病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，后續(xù)工作需進(jìn)一步研究PTGER4基因具體通過(guò)何種途徑參與CD 炎癥病理性改變。