陳夢(mèng)迪 楊雁婷 鄧治楊 徐洪燕 鄧吉楠 楊忠 胡寧 楊軍

摘?要?設(shè)計(jì)并制作了一款由兩種大小不同微球?qū)盈B堆積的微通道與毛細(xì)通道陣列組合而成的微流控芯片裝置，可以在全血樣本流經(jīng)微通道過(guò)程中，通過(guò)微球堆積層過(guò)濾、吸附其中的細(xì)胞組分，快速分離出血漿。采用負(fù)壓進(jìn)樣方式在微通道中緊密堆積微球，并采用蛋白封閉液包被的方法增加微球表面親水性，在毛細(xì)作用下，芯片烘干冷卻后滴入的全血在微通道中前進(jìn)，進(jìn)而分離出血漿。測(cè)試了直徑分別為10、15、20、23和40 μm的不同微球?qū)ρ獫{分離速度的影響，當(dāng)使用直徑為10 μm的微球堆積通道時(shí)，血漿分離速率最快?？疾炝硕逊e通道局部加寬設(shè)計(jì)等對(duì)血漿分離的影響，結(jié)果表明，相較于長(zhǎng)直型通道，局部加寬通道的血漿分離速率大大增加，最快可達(dá)0.16 μL/min，可在短時(shí)間內(nèi)收集得到足量血漿，滿(mǎn)足大多數(shù)臨床血液檢測(cè)等相關(guān)要求。利用本方法收集的血漿樣本在芯片上進(jìn)行血液凝集實(shí)驗(yàn)，可快速分析待測(cè)血液血型，具有良好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞?血漿; 微流控芯片; 全血; 毛細(xì)作用; 過(guò)濾

1?引 言

全血由紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血小板等血細(xì)胞和血漿組成[1]，血細(xì)胞占全血的40%～45%，血漿占55%～60%。血漿成分復(fù)雜，主要包括蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、無(wú)機(jī)鹽、糖等，很多成分與人體的各種生命活動(dòng)直接相關(guān)，因此， 檢測(cè)分析血漿成分對(duì)基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究及臨床檢測(cè)都有重要意義[2]。由于血細(xì)胞及其所含物質(zhì)常會(huì)干擾血漿成分分析，在相關(guān)檢測(cè)中，需提前去除血細(xì)胞。在傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室分析方法中，分離血漿最常用的方式是對(duì)全血進(jìn)行離心操作，取上清液即可得到血漿。但是，血液即時(shí)檢測(cè)（Point-of-care testing， POCT）設(shè)備得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，基于離心的血漿制備方法由于所需裝置較大、成本較高，難以滿(mǎn)足實(shí)際檢測(cè)要求[3]。

微流控芯片因其結(jié)構(gòu)尺寸小、成本低、通量高、試劑消耗少、反應(yīng)快等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛用于各種POCT設(shè)備中[4]。對(duì)于全血中血漿的分離，微流控技術(shù)同樣具有巨大應(yīng)用潛力，因此成為目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，已有多種不同的微流控裝置被用于血漿分離研究中[5～14]。其中，具有天然多孔結(jié)構(gòu)的纖維薄膜、濾紙等材料較多用于微流控血漿分離，對(duì)血液的操作可采用類(lèi)似傳統(tǒng)生化試紙的側(cè)向流層析方法，如目前常見(jiàn)的紙質(zhì)芯片結(jié)構(gòu)[5]。此外，也有研究利用紅細(xì)胞的側(cè)向位移，在靠近壁的一側(cè)形成一層無(wú)細(xì)胞區(qū)域以分離血漿[6]。另一類(lèi)方法則較多依賴(lài)于多孔薄膜的過(guò)濾作用[7，8]。這些裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、成本低廉，但是所得到的血漿量通常較少，而且是吸附在多孔結(jié)構(gòu)中或薄膜表面上。同時(shí)，這類(lèi)結(jié)構(gòu)的濾孔也易被堵塞，實(shí)際應(yīng)用范圍有限。由于微流控技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分離領(lǐng)域[9]，因而又陸續(xù)出現(xiàn)了多種微流控結(jié)構(gòu)及操作方法以實(shí)現(xiàn)血漿分離?；阱e(cuò)流過(guò)濾的微流控血漿分離方法[10，11]，利用單一通道尺寸小于血細(xì)胞的微通道陣列限制血細(xì)胞的流動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)血細(xì)胞和血漿在平行通道中的分配，達(dá)到分離血漿的目的。模仿體內(nèi)毛細(xì)血管中細(xì)胞流動(dòng)的Zweifach-Fung效應(yīng)（即分支毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)中血細(xì)胞傾向于流入流速更高通道的一種效應(yīng)）也被用于血漿分離芯片的構(gòu)建[12，13]，血液流經(jīng)微通道的分叉處時(shí)，由于受到較強(qiáng)壓力梯度的作用，絕大多數(shù)血細(xì)胞傾向于流入流速高的微通道中，從而實(shí)現(xiàn)血漿在低速分支通道中的分離。在微流控芯片中，還可利用一些特殊幾何結(jié)構(gòu)構(gòu)成的陣列，如通道中突起的斜紋結(jié)構(gòu)陣列，改變血細(xì)胞的流動(dòng)方向，并向特定方位富集，從而實(shí)現(xiàn)血漿分離[14]。除了各種微結(jié)構(gòu)，流體的特殊微流控操作也可用于血漿分離。如在慣性微流過(guò)濾中，利用微通道中細(xì)胞所受慣性升力的平衡點(diǎn)，可使血細(xì)胞穩(wěn)定在通道橫截面中某個(gè)位置形成聚焦流動(dòng)，從而完成血細(xì)胞的分離[15]。相比于傳統(tǒng)的多孔介質(zhì)的血液滲流及過(guò)濾分離方法，基于特殊微結(jié)構(gòu)或者微流控操作技術(shù)的血漿分離方法速度更快，所得到的血漿量也更多，更適于POCT分析。但是，在微通道中加工各種微結(jié)構(gòu)的工藝復(fù)雜，造價(jià)昂貴; 而各種微流控操作方法對(duì)加工及流動(dòng)控制精度的要求也較高; 同時(shí)，很多血漿分離都需對(duì)血液做稀釋等預(yù)處理，不適合直接對(duì)全血進(jìn)行操作，限制了其推廣應(yīng)用。

Shim等[16]利用不同尺寸的微球在微流控芯片的進(jìn)樣池與微通道連接處堆積形成一個(gè)過(guò)濾系統(tǒng)，通過(guò)微球間間隙對(duì)血細(xì)胞的阻擋作用及血液的毛細(xì)作用，選擇性地使血漿更快流到后端微流控通道中，實(shí)現(xiàn)血漿的快速分離。該方法依賴(lài)于微流控結(jié)構(gòu)中的毛細(xì)作用，不需外加驅(qū)動(dòng)裝置，結(jié)構(gòu)和制作簡(jiǎn)單，分離速度也較快。但是，該設(shè)計(jì)在實(shí)際應(yīng)用中還存在一些問(wèn)題，如微球僅依靠相互粘結(jié)固定在微通道入口位置，抵抗外力干擾能力弱，容易脫落、移位。血漿分離完全依靠毛細(xì)作用驅(qū)動(dòng)，流動(dòng)通道尺寸不能太大，這也導(dǎo)致單一通道設(shè)計(jì)很難將足夠分離血漿輸送到后端尺寸較大的檢測(cè)微腔室等結(jié)構(gòu)中（這些結(jié)構(gòu)中毛細(xì)作用很弱）。由于光學(xué)檢測(cè)技術(shù)等要求，較大檢測(cè)腔室在微芯片生化檢測(cè)及免疫分析等應(yīng)用中廣泛使用[17]; 同時(shí)，較小尺寸的微通道中單次分離血漿量少（一次最多102 nL），也限制了其應(yīng)用范圍。由于微球堆積層厚度較薄，延長(zhǎng)分離時(shí)間會(huì)導(dǎo)致部分紅細(xì)胞穿過(guò)微球堆積層，污染已經(jīng)分離的血漿。

本研究構(gòu)建了一種基于微球堆積微通道和毛細(xì)微通道陣列的微流控芯片結(jié)構(gòu)，利用特定微通道約束不同尺寸的微球，使血液在通過(guò)層疊微球過(guò)程中實(shí)現(xiàn)血細(xì)胞和血漿的分離。血漿分離過(guò)程中，無(wú)需借助外力作用。通過(guò)填裝大量微球于微通道中，可以提高分離的血漿量; 同時(shí)，微球?qū)盈B通道下游的陣列化微通道結(jié)構(gòu)相比單一微通道更有利于大量血漿的收集。探究了微球尺寸和芯片結(jié)構(gòu)對(duì)血漿分離過(guò)程的影響。相較于同類(lèi)型微球堆積血漿分離裝置，本裝置分離血漿速度更快，血漿收集量更大。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

LSP10-1B實(shí)驗(yàn)室十通道注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司）; URE-2000/25型紫外光刻機(jī)（中國(guó)科學(xué)院光電技術(shù)研究所）; PDC-MG等離子清洗機(jī)（成都銘恒科技發(fā)展有限公司）; IX73顯微鏡（日本奧林巴斯公司）; EOS 600D照相機(jī)（日本佳能公司）

磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer saline，PBS）干粉（北京索萊寶科技有限公司）; 吐溫20（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）; 封閉蛋白干粉（美國(guó)博士德生物工程有限公司）; 聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS，美國(guó)Dow Corning公司）; SU8 3050（美國(guó)MicroChem公司）; 二氧化硅微球（直徑分別為10、15、20、23和40 μm，中國(guó)知益微球科技有限公司）。

2.2?芯片設(shè)計(jì)及加工

血漿分離的目的是將血液中的血細(xì)胞與血漿有效分開(kāi)。血細(xì)胞中絕大多數(shù)都是紅細(xì)胞，約占血液體積50%。因此，血漿分離的主要目的就是去掉紅細(xì)胞。紅細(xì)胞呈兩面中央凹的圓餅狀，直徑約8 μm， 厚度約2 μm， 具有極強(qiáng)的變形性，可形變通過(guò)小于其幾何尺寸的孔道，但壓力過(guò)大時(shí)也可能破裂。芯片（圖1）中設(shè)計(jì)了一條填充微球的微通道，通過(guò)微球之間的孔隙一定程度上阻滯紅細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，同時(shí)通過(guò)毛細(xì)作用使血漿快速流經(jīng)微通道，從而實(shí)現(xiàn)血漿的分離。

微流控芯片由上下兩層結(jié)構(gòu)組成（圖1A），上層為PDMS層，下層為玻璃基底層。芯片中的流動(dòng)網(wǎng)絡(luò)主要由全血進(jìn)樣腔、微球?qū)盈B通道、血漿分離通道陣列、血漿收集腔等部分組成。其中，進(jìn)樣腔直徑為4 mm。微球?qū)盈B通道的尺寸為14.8 mm（長(zhǎng)） 4 mm（寬） ?220 μm（高），用以容納微球。通道一側(cè)刻有刻度標(biāo)志（相鄰刻度間距為1 mm），方便確定微球堆積數(shù)量。微球?qū)盈B通道后端與18條尺寸分別為1.5 mm（長(zhǎng)） ?100 μm（寬） ?85 μm（高）的血漿分離通道相連（圖1B）。分離的血漿最后流入尺寸為4.6 mm（長(zhǎng)） ?2.1 mm（寬） ?220 μm（高）的血漿收集腔。在微球裝填過(guò)程中，先將較大尺寸微球填充到微球?qū)盈B通道中，擋住其進(jìn)入血漿分離通道的入口，避免隨后堆積的尺寸較小微球進(jìn)入分離通道中。通過(guò)表面處理使微球表面具有較強(qiáng)的親水性。由于毛細(xì)作用與毛細(xì)管的半徑成反比，因此可以通過(guò)選擇微球尺寸調(diào)節(jié)毛細(xì)作用[18]。微球相互堆積形成孔隙，起到了毛細(xì)管的作用，此處將孔隙模擬為一根長(zhǎng)直的毛細(xì)管，在毛細(xì)管的一端添加液體，不施加其它力的作用，模擬液體在毛細(xì)管內(nèi)的前進(jìn)。采用COMSOL Multiphysics 4.4軟件進(jìn)行仿真。當(dāng)毛細(xì)管直徑變小時(shí)，液體在毛細(xì)管中前進(jìn)的速率明顯加快。

芯片加工時(shí)，首先采用二次光刻法在硅片上制備由兩層不同高度（220 μm/85 μm）的微結(jié)構(gòu)構(gòu)成的母版： （1）在洗凈烘干的硅片上旋涂一層光刻膠SU8 3050（1500 r/min，1 min）; （2）前烘45 min后曝光（27 s）; （3）后烘，顯影得到第一層結(jié)構(gòu)（高85 μm）; （4）重復(fù)操作得到第二層結(jié)構(gòu)（SU8 2050，500 r/min，1 min， 所得光刻膠高220 μm），最終得到有雙層結(jié)構(gòu)的硅片母版。將PDMS倒入固定母版的模具中，除盡氣泡后，在80℃的烘箱中加熱30 min，脫模即可得到具有預(yù)定微結(jié)構(gòu)的PDMS膠塊，然后在PDMS膠塊上進(jìn)樣腔和收集腔氣孔位置打出相應(yīng)尺寸通孔。芯片采用玻璃作為基底材料，玻璃基底具有良好親水性，有利于微球溶液的進(jìn)入。將玻璃基底和PDMS膠塊等離子處理3 min后鍵合，并在150℃熱壓10 min即得到實(shí)驗(yàn)芯片（圖1C）。待芯片冷卻后，盡快加入蛋白封閉液（0.065 g/mL），以包被通道表面，增加其親水性。蛋白封閉液由封閉蛋白干粉溶于吐溫20-PBS緩沖液（1∶2000，V/V）。

2.3?實(shí)驗(yàn)過(guò)程

2.3.1?微球堆積?在芯片中，起過(guò)濾作用的主要是小尺寸的微球。在微球堆積通道中填充微球時(shí)，為避免尺寸小的微球從分離微通道中流失，芯片內(nèi)共堆積兩種尺寸的微球，先堆積直徑100 μm的微球，再堆積較小尺寸的微球。將實(shí)驗(yàn)所用的二氧化硅實(shí)心微球加入去離子水中，形成微球懸液，從進(jìn)樣腔入口加入后，在收集腔出口一端抽氣形成負(fù)壓，可使微球在通道內(nèi)堆積。通過(guò)芯片上的刻度標(biāo)志可以判斷并控制不同微粒堆積量。

在微球堆積過(guò)程中，微球始終浸潤(rùn)在蛋白封閉液中，蛋白在微球表面吸附，可將其表面從疏水性改變?yōu)橛H水性，顯著提高毛細(xì)作用強(qiáng)度。堆積微球的微芯片如圖2A所示。將填充好微球的芯片中的蛋白封閉液盡量抽盡后， 于75℃烘烤至水分全部蒸發(fā)，冷卻后，于4℃放置過(guò)夜，備用。

2.3.2?血漿分離實(shí)驗(yàn)?血液樣本采用作者本人血液，由重慶大學(xué)醫(yī)院采集，經(jīng)重慶大學(xué)醫(yī)院同意，可用于實(shí)驗(yàn)。將20 μL血液樣本加入進(jìn)樣腔中觀察并記錄血漿分離情況（圖2B）。由于毛細(xì)作用，血液會(huì)自動(dòng)在通道內(nèi)前進(jìn)。微球與通道壁及微球間的狹窄縫隙有助于產(chǎn)生較大的毛細(xì)作用力，推動(dòng)血液中的血漿流動(dòng)。較小縫隙對(duì)以紅細(xì)胞為主的血細(xì)胞則有較大阻礙作用。血液在進(jìn)入芯片一段時(shí)間后，紅細(xì)胞和血漿運(yùn)動(dòng)前沿會(huì)出現(xiàn)一定程度的分離。

3?結(jié)果與討論

3.1?血漿的分離

參考文獻(xiàn)[16]的研究結(jié)果，在實(shí)驗(yàn)中先選擇直徑分別為100 μm和15 μm的兩種尺寸的微球，其中大微球的填充量約0.88 μL（占據(jù)1 mm長(zhǎng)的通道），小微球的填充量約12.32 μL（占據(jù)14 mm長(zhǎng)通道）。當(dāng)血液從進(jìn)樣腔加入芯片后，血漿在毛細(xì)作用下向前運(yùn)動(dòng)，而血液中的紅細(xì)胞由于微球的阻礙而逐漸滯后。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，血漿（圖3中的透明部分）運(yùn)動(dòng)的前沿明顯超越紅細(xì)胞（紅色部分）的運(yùn)動(dòng)前沿，表明部分血漿成分逐漸從血液中分離出來(lái)。從微球區(qū)域流出的血漿在下游的分離通道陣列中快速流動(dòng)，隨后進(jìn)入收集腔逐漸積累。芯片中收集腔和微粒堆積通道高度均為220 μm，而中間的分離通道高度為85 μm，當(dāng)血漿從不同分離通道進(jìn)入收集腔時(shí)，不同分離通道流入的血漿逐漸匯流到一起，從收集腔的角落處開(kāi)始慢慢積累（圖3C）。最后，收集腔中得到淡黃色透明血漿，說(shuō)明在整個(gè)分離過(guò)程中基本沒(méi)有紅細(xì)胞被擠壓破裂。

相對(duì)于Shim等[16]設(shè)計(jì)的芯片結(jié)構(gòu)，本研究中的芯片更厚的微球堆積層可實(shí)現(xiàn)更多的血漿分離; 同時(shí)，由18條分離通道構(gòu)成的陣列可同時(shí)輸送更多的血漿進(jìn)入收集腔室。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，由于血漿的不斷分離，剩余血液中血細(xì)胞濃度不斷增加，粘度也不斷加大，流速減慢，導(dǎo)致最終未分離的血液（主要是紅細(xì)胞）會(huì)停留在微通道的某一位置。因此，可以選擇合適的微球填充量，在保證血清分離效果的同時(shí)，提高分離速度。影響血漿分離的主要因素在于填充微球的尺寸，在隨后的研究中，探討了不同微球尺寸的影響。

3.2?不同小微球尺寸的影響

直徑100 μm的大微球主要用于阻止較小微球進(jìn)入分離通道，對(duì)整個(gè)血漿分離過(guò)程無(wú)明顯影響。因此，實(shí)驗(yàn)中大微球的尺寸及填充量保持不變，只考察直徑分別為10、15、20、23和40 μm的5種小微球?qū)ρ獫{分離的影響。微球尺寸的選擇主要參考紅細(xì)胞大小以及可選擇的商業(yè)化微球尺寸。小微球在微通道中的填充尺寸保持一致。

針對(duì)不同尺寸的微粒均進(jìn)行5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)微球尺寸較大（40 μm）時(shí)，微球間的孔隙不足以阻礙血細(xì)胞隨液體成分的運(yùn)動(dòng)，不能觀察到血細(xì)胞和血漿之間有明顯的分離。因此，在后面的分析討論中，主要討論尺寸較小的4種微球的影響。血液在微球中前進(jìn)，分成血漿和血細(xì)胞兩部分，形成前后兩條運(yùn)動(dòng)前沿，記下不同時(shí)刻血漿和血細(xì)胞運(yùn)動(dòng)前沿離微球堆積邊緣的距離，當(dāng)運(yùn)動(dòng)前沿不規(guī)則時(shí)，取血漿和紅細(xì)胞移動(dòng)前沿左右邊緣差的中點(diǎn)處作為前沿，繪制血漿和血細(xì)胞前進(jìn)距離與時(shí)間線圖（圖4）。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)通道中填充尺寸分別為10、15、20和23 μm的較小微球后，血液中血漿和血細(xì)胞的前進(jìn)速度出現(xiàn)了不同程度的差異（圖4），血細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)滯后于血漿。經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，多數(shù)微球填充通道中，血細(xì)胞會(huì)停留在某一位置不再繼續(xù)運(yùn)動(dòng)，血細(xì)胞停止運(yùn)動(dòng)的位置和血液剛進(jìn)入微球堆積區(qū)之間距離為血細(xì)胞前進(jìn)距離。

實(shí)驗(yàn)中，直徑10 μm微球填充的微通道中血漿流速明顯更快，只需9.8 min，血漿即可通過(guò)全部微球填充區(qū)。對(duì)于直徑分別為15和23 μm的微球，血漿流過(guò)微球填充區(qū)的時(shí)間差別不大，約在2225 min，而直徑20 μm微球填充的微通道中血漿流速最慢，需要近100 min血漿才能流出。而對(duì)于直徑分別為10、15和20 μm的微球，血漿和紅細(xì)胞前進(jìn)的速度差異明顯，血漿容易分離; 前兩種微球填充通道中血細(xì)胞前進(jìn)距離約為8 mm（分別為（8.50±1.29） mm、（9.10±1.29） mm）的位置，而直徑20 μm的微球堆積通道中，血細(xì)胞前進(jìn)距離為（11.38±0.75） mm。在直徑23 μm的微球填充的通道中，血漿和紅細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)速度差異不大，分離困難，而且紅細(xì)胞可以流過(guò)微球堆積層。

血液在微通道中運(yùn)動(dòng)的驅(qū)動(dòng)力主要源自毛細(xì)作用和由液面差引起的靜壓力，阻力主要來(lái)自微通道的流阻。而對(duì)于血液中的細(xì)胞，驅(qū)動(dòng)力主要是血液運(yùn)動(dòng)對(duì)細(xì)胞的粘性力，阻力則主要是微球間隙對(duì)細(xì)胞的阻礙作用。對(duì)于較小的空隙，毛細(xì)作用更強(qiáng)，但是流阻也更大。由于血液是非牛頓流體，而且血細(xì)胞與微球的相互作用會(huì)對(duì)空隙幾何形態(tài)及流體運(yùn)動(dòng)本身產(chǎn)生很大影響，要準(zhǔn)確計(jì)算各種條件下血液的流動(dòng)情況很困難。就實(shí)驗(yàn)結(jié)果而言，在直徑10 μm微球填充的通道中，毛細(xì)作用的影響更為明顯，血漿流動(dòng)速度（（1.54±0.60）mm/min）比更大微球填充的通道快很多。在直徑>15 μm微球填充的通道中，微球間隙增加導(dǎo)致毛細(xì)作用減弱，但同時(shí)流阻也在減小。在微球直徑<20 μm時(shí)，毛細(xì)作用減弱的影響更大，因而血漿流動(dòng)速度逐漸減慢; 在微球直徑>20 μm（如23 μm）時(shí)，較大的微球間隙產(chǎn)生的阻力很小，血漿的流動(dòng)速度又增加。對(duì)于紅細(xì)胞，較大微球間縫隙的增加更有利于紅細(xì)胞變形通過(guò)，因此紅細(xì)胞在微球堆積通道中的前進(jìn)距離也隨微球尺寸的增加而逐漸增大。對(duì)于目前采用的芯片結(jié)構(gòu)，直徑>23 μm的微球不能將紅細(xì)胞完全停留在微球堆積通道中，長(zhǎng)時(shí)間分離操作會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞進(jìn)入下游的分離通道及收集腔，影響分離效果。因此，為了保證血漿分離效果及血漿獲取量，需在微通道中填充足夠長(zhǎng)度的微球堆積層。對(duì)于本研究所測(cè)試的微球，在通道中填充直徑10 μm微球是較好的選擇。一方面，血漿分離速度更快，有利于快速的POCT操作; 另一方面，紅細(xì)胞移動(dòng)距離更短，實(shí)際應(yīng)用中需要的微球堆積量相對(duì)更少。

3.3?微球堆積通道結(jié)構(gòu)的影響

為了提高血漿分離速度，本研究對(duì)微球堆積通道結(jié)構(gòu)做了改進(jìn)。文獻(xiàn)[16]表明，堆積于通道口的微球?qū)雍穸仍酱?，外圍面積也越大，從而可以提高血漿分離量和分離速度。因此，本研究加寬了芯片的微球堆積通道的中部，希望通過(guò)提高微球堆積的數(shù)量及橫截面尺寸提高血漿分離速度。新的芯片結(jié)構(gòu)如圖5A所示，微球堆積通道最寬處增加到7.5 mm，通道變寬部分總長(zhǎng)度為8.5 mm。此結(jié)構(gòu)由于通道寬度較寬且通道結(jié)構(gòu)不規(guī)則，在用負(fù)壓進(jìn)行通道內(nèi)微球堆積時(shí)， 會(huì)出現(xiàn)微球堆積邊界與流動(dòng)方向不完全垂直的情況（圖5A），但是對(duì)實(shí)際分離實(shí)驗(yàn)的影響有限。

為了考察不同芯片結(jié)構(gòu)下血漿分離速度的差異，比較了兩種芯片中血漿的流量大小。由于兩種芯片中通道深度相同，實(shí)驗(yàn)中只需比較兩種芯片中血漿單位時(shí)間擴(kuò)展面積的差異，流速單位mm2/s指平均每秒血漿前進(jìn)所覆蓋的微球面積，如血漿在100 s內(nèi)通過(guò)了面積為60 mm2的微球填充區(qū)，則流速為0.6 mm2/s。當(dāng)在芯片進(jìn)樣腔滴加20 μL血液時(shí)，新設(shè)計(jì)的通道結(jié)構(gòu)中血漿流速比直通道都大（圖5B），其中直徑10 μm微球填充的通道差別最為明顯。在新設(shè)計(jì)的結(jié)構(gòu)中，由于通道部分加寬，血液與微球接觸面更大，通道加寬部分相當(dāng)于增加了更多的微小毛細(xì)管，更有利于血漿的運(yùn)動(dòng)。當(dāng)采用直徑10 μm微球填充時(shí)，血漿的分離速率可達(dá)到0.16 μL/min，短時(shí)間內(nèi)分離產(chǎn)生的血漿量即可滿(mǎn)足多數(shù)分析的要求。

3.4?不同小微球尺寸對(duì)血漿積累速率的影響

當(dāng)血漿穿過(guò)全部微球堆積區(qū)域，進(jìn)入血漿分離通道陣列并在后續(xù)的出口腔堆積，記錄從血漿開(kāi)始在出口腔堆積直到血漿鋪滿(mǎn)整個(gè)出口腔的時(shí)間，計(jì)算出不同微球填充芯片的血漿積累速率。在微球填充區(qū)域，不同直徑的微球形成不同粗細(xì)的孔隙，因而血漿在其中的前進(jìn)速度也不同，即血漿的產(chǎn)出速度不同。在芯片中填充不同尺寸（直徑分別為10、15、20、23 μm）、但填充量相同的微球，探究微球尺寸對(duì)血漿積累速率的影響。每個(gè)尺寸微球分別進(jìn)行3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)并統(tǒng)計(jì)結(jié)果。其中，只有直徑10和15 μm微球填充的芯片能夠在出口腔積滿(mǎn)血漿，即收集到3.29 μL血漿; 20 μm微球填充芯片收集血漿速率極緩慢，產(chǎn)出血漿量不足以將出口腔填滿(mǎn); 23 μm芯片由于孔隙較大，有部分紅細(xì)胞進(jìn)入出口腔，所收集血漿純度不高。統(tǒng)計(jì)得出直徑10和15 μm微球填充的芯片中血漿積累速率分別為（0.160±0.025） μL/min和 （0.030±0.007） μL/min。10 μm微球填充的芯片中血漿堆積速度遠(yuǎn)快于15 μm， 這與3.2節(jié)中所討論的血漿在10 μm微球填充通道的前進(jìn)速度遠(yuǎn)大于在15 μm微球的現(xiàn)象相符合。將血漿視為無(wú)數(shù)個(gè)體積元，在10 μm填充通道中，每個(gè)體積元穿過(guò)微球間孔隙的速度大于在15 μm微球中的速度。當(dāng)血漿體積元通過(guò)全部微球填充區(qū)，進(jìn)入血漿分離通道陣列，到達(dá)出口腔并開(kāi)始積累，微球的尺寸對(duì)體積元的前進(jìn)和積累速率不再有影響。本研究尚未考慮血漿分離通道陣列的尺寸對(duì)血漿積累速率的影響，可以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探究。

3.5?凝集實(shí)驗(yàn)分析

血漿分離是生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)的重要環(huán)節(jié)，分離得到的血漿可用于多種檢測(cè)，如常見(jiàn)的免疫及生化分析[17]。本研究為了驗(yàn)證分離得到的血漿是否能夠滿(mǎn)足一般的測(cè)試要求，以分離得到的血漿作為樣本，與另一個(gè)血液樣本進(jìn)行凝集實(shí)驗(yàn)。凝集實(shí)驗(yàn)是一種常見(jiàn)的臨床血液分析手段，常用于血型鑒定和交叉配血實(shí)驗(yàn)（Blood cross-matching test）[19]等?；谖⑶?qū)盈B通道的血漿分離方法結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，分離速度快，血漿純度高，血漿量大，在交叉配血實(shí)驗(yàn)等對(duì)檢測(cè)方便性和速度要求很高的應(yīng)用中極具潛力。

凝集實(shí)驗(yàn)中，不同血型的血液中紅細(xì)胞表面抗原不同，血漿中含有與之兼容的抗體，如A型血紅細(xì)胞表面抗原是凝集原A，其血漿含抗B凝集素。通過(guò)將待測(cè)血液中的紅細(xì)胞和已知標(biāo)準(zhǔn)血漿混合，根據(jù)紅細(xì)胞是否出現(xiàn)凝集分析待測(cè)紅細(xì)胞表面含有何種抗原，從而判斷待測(cè)血液的血型[20，21]。實(shí)驗(yàn)中，收集腔中積滿(mǎn)血漿后，將1 μL待測(cè)血液樣本用微量進(jìn)樣器加入收集腔，輕輕擠壓芯片，使血液和血漿樣本混合，觀察出口腔情況。當(dāng)待測(cè)血液和血漿發(fā)生凝集時(shí)，待測(cè)血液紅細(xì)胞在進(jìn)入血漿后不會(huì)分散，反而聚集成團(tuán)。在擠壓混合后，出現(xiàn)絮狀的紅細(xì)胞團(tuán)塊（圖6A）。在顯微鏡下觀察，收集腔中紅細(xì)胞呈團(tuán)塊，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象（圖6B）。如未發(fā)生凝集，待測(cè)血液紅細(xì)胞進(jìn)入血漿后，分散并在收集腔室內(nèi)鋪開(kāi)，呈淡紅色均勻分布，擠壓混合后沒(méi)有變化（圖6C）。紅細(xì)胞均勻分布，無(wú)凝集現(xiàn)象（圖6D）。

4?結(jié) 論

本研究設(shè)計(jì)了一種全血過(guò)濾芯片，通過(guò)微通道中填充的微球過(guò)濾分離血漿。不同尺寸微球的分析結(jié)果表明，在微通道中填充直徑10 μm的微球，血漿分離速度最快，而且微球需要量最低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，局部擴(kuò)大微球填充通道尺寸，有助于血漿的快速分離，也可收集到更多的血漿。通過(guò)凝集實(shí)驗(yàn)表明芯片收集血漿技術(shù)可應(yīng)用于臨床檢測(cè)。相對(duì)于現(xiàn)有的入口微球填充方法，新設(shè)計(jì)的芯片可得到更多血漿，并收集到一個(gè)檢測(cè)腔室中，適用范圍更廣。而且，微球固定更加穩(wěn)定，更有利于實(shí)際應(yīng)用。因此，基于微球填充通道的血漿分離裝置有望成為POCT設(shè)備中的關(guān)鍵器件。

References

1?Gifford S C， Strachan B C， Xia H， Vrs E， Torabian K， Tomasino T A， Griffin G D， Lichtiger B， Aung F M， Shevkoplyas S S. PLoS One， 2018， 13（1）： e0190827

2?Sarangadharan I， Wang S L， Sukesan R， Chen P C， Dai T Y， Pulikkathodi A K， Hsu C P， Chiang H H K， Liu L Y M， Wang Y L. Anal. Chem.， 2018， 90（4）： 2867-2874

3?Koukouvinos G， Goustouridis D， Misiakos K， Kakabakos S， Raptis I， Petrou P. Sens. Actuators B， 2018， 260： 282-288

4?Nasseri B， Soleimani N， Rabiee N， Kalbasi A， Karimi M， Hamblin M R. Biosens. Bioelectron.， 2018， 117： 112-128

5?Li H， Han D， Pauletti G M， Steckl A J. Lab Chip， 2014， 14（20）： 4035-4041

6?Marchalot J， Fouillet Y， Achard J L. Microfluid. Nanofluid.， 2014， 17（1）： 167-180

7?Madadi H， Casals-Terre J， Mohammadi M. Biofabrication， 2015， ?7（2）： 025007

8?Moorthy J， Beebe D J. Lab Chip， 2003， ?3： 62-66

9?CHEN Li， ZHENG Xiao-Lin， HU Ning， YANG Jun， LUO Hong-Yan， JIANG Fan， LIAO Yan-Jian. Chinese J. Anal. Chem.， 2015， 43（2）： 300-309

陳 禮， 鄭小林， 胡 寧， 楊 軍， 羅洪艷， 姜 帆， 廖彥劍. 分析化學(xué)， 2015， 43（2）： 300-309

10?Vandelinder V， Groisman A. Anal. Chem.， 2006， ?78（11）： 3765-3771

11?Kang T G， Yoon Y J， Ji H M， Lim P Y， Chen Y. J. Micromechan. Microeng.， 2014， 24（8）： 087001

12?Yang S， Undar A， Zahn J D. Lab Chip， 2006， 6（7）： 871-880

13?Maria M S， Kumar B S， Chandra T S， Sen A K. Biomed. Microdevices， 2015， 17（6）： 115

14?Kim B， Oh S， You D， Choi S. Anal. Chem.， 2017， 89（3）： 1439-1444

15?Xiang N， Ni Z. Biomed. Microdevices， 2015， 17（6）： 110

16?Shim J S， Ahn C H. Lab Chip， 2012， 12（5）： 863-866

17?Lee B S， Lee Y U， Kim H S， Kim T H， Park J， Lee J G， Kim J， Kim H， Lee W G， Cho Y K. Lab Chip， 2011， 11（1）： 70-78

18?Li C， Liu C， Xu Z， Li J. Biomed. Microdevices， 2012， 14（3）： 565-572

19?Park J， Park J K. Lab Chip， 2018， 18（8）： 1215-1222

20?Beck M L， Tilzer L L. Trans. Med. Rev. 1996， 10（2）： 118-130

21?Makulska S， Jakiela S， Garstecki P. Lab Chip， 2013， 13（14）： 2796-2801