王霞 徐燦 吳秀園 孫雯婷 王英鋒 李中峰

摘?要?應(yīng)用核磁共振（NMR）代謝組學(xué)方法研究狼毒大戟根部毒性導(dǎo)致大鼠糞便代謝物的變化。將36 只SPF級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為3組，給藥組大鼠腹腔注射高低兩個(gè)劑量的狼毒大戟根部醇提物，對(duì)照組給予同體積含有3% 吐溫80的生理鹽水。每天給藥一次，連續(xù)給藥15天后停藥恢復(fù)15天，收集各組大鼠的糞便樣品。利用NMR技術(shù)檢測(cè)大鼠糞便中代謝物，對(duì)得到的1H-NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，獲取大鼠糞便中內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律。通過Student t檢驗(yàn)進(jìn)一步確定具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物標(biāo)志物。大鼠糞便中鑒定出35種代謝物，狼毒大戟導(dǎo)致12種代謝物變化顯著，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、二甲胺、三甲胺、尿嘧啶含量下降，葡萄糖、丁酸含量升高。這些與腸道菌群有關(guān)的代謝物變化表明，狼毒大戟毒性導(dǎo)致大鼠的腸道菌群紊亂，進(jìn)而造成了大鼠體內(nèi)氨基酸、短鏈脂肪酸和葡萄糖代謝異常，為進(jìn)一步揭示狼毒大戟的毒性提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞?狼毒大戟; 代謝組學(xué); 糞便; 核磁共振

1?引 言

據(jù)《中藥大辭典》記載，狼毒大戟（Euphorbia fischeriana Steud）為大戟科大戟屬草本植物，主要分布在我國的河北、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古、吉林等地。狼毒大戟以根入藥，具有抗癌、抗白血病、抗菌、抗病毒和抗痛風(fēng)、殺蟲、抗氧化等作用[1，2]。由于狼毒大戟具有多種藥效作用，尤其在抗腫瘤方面具有良好的活性而受到廣泛關(guān)注。然而，《本草綱目》中記載：狼毒（根）辛、平、有大毒。胡爽等[3]在狼毒大戟急性毒性實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠腹腔注射較高劑量的狼毒大戟根部提取物后，明顯出現(xiàn)活動(dòng)困難、呼吸急促、步態(tài)不穩(wěn)等現(xiàn)象，并有一定數(shù)量的小鼠死亡。狼毒大戟因?yàn)榫哂休^大的毒性，其應(yīng)用受到了限制。因此，充分認(rèn)識(shí)和了解狼毒大戟的毒性是其安全、合理使用的前提。

代謝組學(xué)是通過對(duì)生物體內(nèi)所有代謝物進(jìn)行定量分析，研究機(jī)體代謝產(chǎn)物變化的方法。代謝組學(xué)可以反映機(jī)體在疾病侵襲、藥物干預(yù)等作用下，內(nèi)源性小分子代謝物種類、數(shù)量的變化情況[4]，從而得到機(jī)體代謝變化的信息，已經(jīng)應(yīng)用于中藥毒性[5]、疾病診斷[6]、藥物作用機(jī)制[7]等領(lǐng)域。核磁共振（NMR）技術(shù)具有對(duì)樣品預(yù)處理簡單、無破壞性、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)和無偏向檢測(cè)等特點(diǎn)[4]，通過對(duì)體液、組織或糞便等生物樣品進(jìn)行測(cè)定，得到體內(nèi)小分子代謝物的豐富信息，已成為代謝組學(xué)中強(qiáng)有力的研究工具[8]?；诤舜殴舱竦拇x組學(xué)技術(shù)可以最大程度揭示生物體所產(chǎn)生的整體性的代謝變化，已被廣泛應(yīng)用在中藥藥效評(píng)價(jià)[9]、中藥藥理[10]和中藥毒理機(jī)制[11]等方面。胡永勝等[13]采用核磁共振代謝組學(xué)方法研究了雷公藤紅素對(duì)大鼠糖尿病潰瘍促愈合作用的機(jī)制。糞便是腸道菌群和宿主的共代謝產(chǎn)物[13]，糞便代謝作為研究機(jī)體代謝的一個(gè)重要方面，可以反映出腸道菌群對(duì)藥物、食物等的代謝情況[14，15]，為藥物研究提供重要信息。

本研究利用NMR代謝組學(xué)方法研究狼毒大戟根部醇提物對(duì)大鼠糞便代謝物的變化，篩選造成腸道菌群紊亂的相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物，初步從分子水平對(duì)狼毒大戟毒性作用機(jī)制進(jìn)行研究，為狼毒大戟的毒性及毒性機(jī)制的探討提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為研究腸道菌群和機(jī)體代謝的緊密關(guān)系提供新思路。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Heraeus Multifuge X1R臺(tái)式離心機(jī)（美國Thermo公司）; BSA124S-CW分析天平（德國Sartorius公司）; 600 MHz Varian VNMRS核磁共振波譜儀（美國Varian公司）; Rotavapor R-220中型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi 公司）、Cascada Bio Mk2超純水機(jī)（美國PALL公司）。

狼毒大戟干燥根部（河北安國義全中藥有限公司）經(jīng)首都師范大學(xué)王英鋒教授鑒定為狼毒科（Euporbiaceae）大戟屬（Euphorbia ）植物狼毒大戟（Euphorbia Fischeriana Steud ）的根。NaH2PO4（99.5%）、K2HPO4（98%），購于美國Amresco公司; 吐溫80（化學(xué)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）; 重水（D2O，99.9%氘代，美國Cambridge Isotope Laboratories公司）; 2，2，3，3-氘代三甲基硅烷丙酸鈉（TSP，98%氘代，美國Cambridge Isotope Laboratories公司）; 疊氮化鈉（NaN3，分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠）。

SPF級(jí)SD雄性大鼠購于斯貝福（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司。

2.2?狼毒大戟醇提物的制備

按照課題組前期提取方法，取1.5 kg狼毒大戟干燥根部，粉碎，按質(zhì)量體積比1∶9加入70%乙醇，浸泡過夜（>12 h），60℃加熱提取2次，每次1.5 h。藥液靜置，冷卻至室溫后減壓回收乙醇，水浴蒸干，真空冷凍干燥，得到狼毒大戟根部醇提物。取狼毒大戟根部醇提物溶解在含有3%（V/V）吐溫80的生理鹽水中，其中，吐溫80用于增大狼毒大戟醇提物的溶解度。將混合液超聲30 min，配制成相應(yīng)濃度的狼毒大戟醇提物溶液。

2.3?動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)條件為室溫（25±5）℃，濕度60%±10%，12 h晝夜循環(huán)模擬自然光照，自由飲水?dāng)z食。實(shí)驗(yàn)劑量設(shè)置參考前期小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)，小鼠給藥最高劑量為0.13 g/kg，換算到大鼠實(shí)驗(yàn)高劑量為0.10 g/kg。

36只SPF級(jí)SD雄性大鼠，體重280～320 g。隨機(jī)分為3組，其中高劑量組14只、低劑量組12只、對(duì)照組10只。每組劑量等比級(jí)數(shù)為1∶0.5，劑量設(shè)置為0.10和0.05 g/kg，對(duì)照組為含有3%吐溫80的生理鹽水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，在每次收集糞便時(shí)，需在給藥前禁食不禁水12 h。每天8：00～9：00腹腔注射給藥一次，注射體積為0.5 mL/100 g體重。連續(xù)給藥15天，依據(jù)大鼠體重變化隨時(shí)調(diào)整藥量。第16天起停止給藥，恢復(fù)15天。給藥前一天記為第0天，給藥期間每隔一天收集9：00～15：00的大鼠糞便樣品，恢復(fù)期間每隔4天收集9：00～15：00的大鼠糞便樣品。即第0、1、3、5…15、20、25、29天收集糞便樣品，糞樣收集后立即以液氮速凍，于80℃保存。

2.4?樣品處理

稱取50 mg大鼠糞樣于2 mL離心管中，加入500 μL磷酸鹽緩沖液（NaH2PO4-K2HPO4，0.1 mol/L，pH=7.4），緩沖液使用50% D2O配制，其中含有0.002% （w/V） TSP和0.1% （w/V） NaN3，分別作為化學(xué)位移內(nèi)標(biāo)和防腐劑。渦旋充分混勻后， 用液氮反復(fù)凍融3次。凍融物進(jìn)行勻漿（20 Hz，90 s），勻漿液于4℃，10000 g離心10 min。取出上清液，剩余沉淀物用相同方法再提取2次，將3次操作所得到的所有上清液混合后再離心（4℃，16000 g，10 min），取上清液550 μL轉(zhuǎn)移至5 mm NMR樣品管中， 進(jìn)行NMR檢測(cè)。

2.5?核磁共振數(shù)據(jù)的采集

25℃下，在Varian VNMRS 600 MHz核磁共振波譜儀上采用預(yù)飽和的1D-?NOESY脈沖序列測(cè)定糞便水溶樣的1H-NMR譜，1H的共振頻率為599.808 MHz。實(shí)驗(yàn)參數(shù)為：譜寬12000 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)64 K，信號(hào)累加128次，混合時(shí)間（tm）為100 ms，在弛豫延遲期間采用預(yù)飽和方式壓制水峰信號(hào)。為進(jìn)一步對(duì)1D譜中的信號(hào)進(jìn)行歸屬，選取具有代表性的樣品， 采集一系列的2D NMR譜，如1H-1H COSY、1H-1H TOCSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC等。

2.6?數(shù)據(jù)處理

譜圖使用MestReNova軟件（Version 7.1.2，西班牙Mestrelab Research公司）進(jìn)行手動(dòng)相位、基線校正后，用內(nèi)標(biāo)TSP的單峰定標(biāo)（δ 0.00）。對(duì)δ 0.5～9.5區(qū)域的圖譜進(jìn)行分段積分，積分區(qū)間寬為0.002 ppm。為了消除殘余水峰信號(hào)的影響，剪掉譜圖中δ 4.7～5.2區(qū)間。對(duì)積分后的數(shù)據(jù)進(jìn)行總面積歸一化處理，然后導(dǎo)入SIMCA-P+（Version 12.0， 瑞典Umetrics公司）進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析。主成分分析（PCA）使用中心化換算（Ctr）的數(shù)據(jù)標(biāo)度換算方式，它可以反映樣品整體的分布趨勢(shì)，同時(shí)可以觀察到組內(nèi)有無異常點(diǎn)，分析結(jié)果以得分圖（Scores plots）顯示。歸一化所得數(shù)據(jù)經(jīng)單位方差換算（UV）標(biāo)度化處理后，進(jìn)行偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）。其中，PLS-DA用于分析NMR數(shù)據(jù)與分組變量之間的關(guān)系，同時(shí)得到變量投影重要性（VIP）>1的代謝物信息。用舍一法對(duì)模型進(jìn)行交叉驗(yàn)證，參數(shù)R2和Q2分別表示模型擬合情況和預(yù)測(cè)能力，然后通過排列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證模型的有效性。最后以O(shè)PLS-DA最大化凸顯組別之間的差異，并利用MATLAB R2012a軟件（Version 7.1， 美國 Mathworks 公司）結(jié)合自編程序作出相關(guān)系數(shù)圖，圖中顏色沿著右側(cè)越接近紅色，表示相應(yīng)代謝物對(duì)組間差異的貢獻(xiàn)越大。根據(jù)兩組中較小的樣本數(shù)，查閱皮爾森相關(guān)系數(shù)臨界值表，當(dāng)某代謝物信號(hào)的相關(guān)系數(shù)絕對(duì)值|r|>r臨界值時(shí)，認(rèn)為該代謝物的變化對(duì)模型的區(qū)分有意義。本研究中，相關(guān)系數(shù)的臨界值分別為0.291（n=45，給藥15天）和0.532（n=13，恢復(fù)15天）。為進(jìn)一步驗(yàn)證差異代謝物的顯著性，對(duì)代謝物對(duì)應(yīng)的積分面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS軟件（Version 17.0，美國SPSS公司）進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，顯著性閾值設(shè)置為p<0.05。當(dāng)3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)得到滿足時(shí)，即VIP>1，P<0.05，|r|≥r臨界值，相應(yīng)的代謝物即可被選為差異代謝物。

3?結(jié)果與討論

3.1?糞便樣品代謝物譜圖分析

圖1為高劑量組（High）、低劑量組（Low）和對(duì)照組（Control）大鼠糞便樣品中具有代表性的1H-NMR譜。根據(jù)代謝物文獻(xiàn)[11，12，16～19]、已有的經(jīng)驗(yàn)及Chenomx NMR Suite 數(shù)據(jù)庫（Version 7.5，加拿大Chenomx公司）和代謝組學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫（HMDB， http：//www.hmdb.ca/），對(duì)譜圖的代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確歸屬。結(jié)合相關(guān)二維譜圖（如1H-1H COSY、1H-1H TOCSY、1H-13C HSQC和1H-13C HMBC等）對(duì)歸屬的代謝物進(jìn)行確認(rèn)。本研究從圖譜中歸屬出35種代謝物。肉眼可分辨出一些特征性差異代謝物，如給藥組中具有較低濃度的尿嘧啶和較高濃度的葡萄糖等。

3.2?多元統(tǒng)計(jì)分析

為了觀察樣本的聚類情況以及排除異常點(diǎn)，對(duì)連續(xù)給藥15天和停藥恢復(fù)15天后所有大鼠糞便樣品的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析。連續(xù)給藥15天所有大鼠糞便樣品的PCA得分如圖2A所示，PC1=55.1%; PC2=16.2%，劑量組與對(duì)照組之間雖有部分重疊，但依然能看出分離趨勢(shì)。由圖2C中PLS-DA得分圖（R2Y=0.776; Q2=0.759）更清晰地顯示出組別之間的分離，其中高劑量組與對(duì)照組區(qū)分更明顯。表明了給藥后大鼠體內(nèi)環(huán)境出現(xiàn)顯著變化，且藥物對(duì)機(jī)體的影響與劑量呈正相關(guān)。圖2B和2D分別為停藥恢復(fù)后劑量組與對(duì)照組的PCA（PC1=52.2%; PC2=13.4%）和PLS-DA（R2Y=0.747; Q2=0.597）得分圖，圖中依然可以觀察到劑量組與對(duì)照組的區(qū)分，表明在停藥恢復(fù)15天后，給藥組與對(duì)照組大鼠仍存在代謝差異。

為了動(dòng)態(tài)觀察狼毒大戟對(duì)大鼠的影響隨時(shí)間的變化情況，對(duì)不同時(shí)間得到的大鼠糞便樣品進(jìn)行時(shí)間-軌跡分析（圖3），圖3中每個(gè)點(diǎn)代表一組大鼠在同一天的平均位置。在給藥初期，劑量組即與對(duì)照組存在明顯差異，此后均在一定范圍內(nèi)波動(dòng)，且高劑量組與對(duì)照組的差異較低劑量組更為明顯。停藥恢復(fù)階段，兩劑量組的變化趨勢(shì)趨于一致，但仍與對(duì)照組保持一定差異。

采用PLS-DA對(duì)給藥期間和恢復(fù)期間高劑量組和對(duì)照組所有大鼠糞便樣品的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。圖4A為連續(xù)給藥15天高劑量組和對(duì)照組大鼠糞便樣品的1H-NMR譜得到的PLS-DA得分圖（R2Y=0.869; Q2=0.848），圖4C為停藥恢復(fù)15天高劑量組和對(duì)照組大鼠糞便樣品的1H-NMR譜得到的PLS-DA得分圖（R2Y=0.794; Q2=0.666）。模型的排列驗(yàn)證（200次）結(jié)果如圖4B和4D所示，Q2回歸線與y軸交點(diǎn)在負(fù)半軸，R2回歸線與y軸交點(diǎn)在正半軸，且R2和Q2的數(shù)值在最右端接近，表明建立的糞便樣品數(shù)據(jù)模型成立，即兩組大鼠糞便樣品中的代謝物存在顯著的差異。