劉建華 王雷 張?zhí)扃? 王建秋 龔雪 崔鳳至 鄭建軍 李波 施展

摘?要?腫瘤早期診斷對(duì)于選擇合適的治療方案至關(guān)重要，而單一模態(tài)磁共振成像（MRI）難以滿足精確診斷的要求。本研究構(gòu)建了聚丙烯酸（PAA）修飾的Fe3O4@MnO2納米粒子（Fe3O4@MnO2@PAA）用于pH響應(yīng)的T1/T2雙模態(tài)MR成像，同時(shí)能夠介導(dǎo)腫瘤的光熱治療。以Fe3O4為核，可以使Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子在磁共振成像的T2信號(hào)明顯減低; MnO2納米殼在腫瘤內(nèi)的酸性環(huán)境下可分解為順磁性的Mn2+，能夠增強(qiáng)T1信號(hào)。這種pH響應(yīng)的T1/T2雙模態(tài)MRI造影劑具有良好的敏感性和特異性，可以為腫瘤診斷提供更全面、更詳實(shí)的信息。此外，F(xiàn)e3O4@MnO2@PAA納米粒子在近紅外區(qū)表現(xiàn)出優(yōu)異的吸收能力，可作為一種良好的光熱轉(zhuǎn)換材料介導(dǎo)腫瘤的光熱治療。這種pH響應(yīng)的雙模態(tài)磁共振成像介導(dǎo)光熱治療的新型納米診療劑，在腫瘤的MRI診斷及光熱治療方面表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛能。

關(guān)鍵詞?診療劑; 磁共振成像; 雙模態(tài)成像; 近紅外光; 光熱治療

1?引 言

磁共振成像（MRI）已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)療，這種影像學(xué)檢查方法對(duì)腫瘤的早期診斷及鑒別診斷具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)，對(duì)于選擇合適的治療手段至關(guān)重要。相比于其它的影像學(xué)檢查方法，如超聲（US）、X線平片（DR）、X線計(jì)算機(jī)斷層攝影（CT）及正電子發(fā)射斷層掃描（PET）等方法，MRI具有更高的圖像分辨率以及空間分辨率，同時(shí)無(wú)電離輻射污染[1]。在臨床上，為了提高M(jìn)RI檢查的準(zhǔn)確性，通常引入造影劑強(qiáng)化病灶部位的磁共振信號(hào)，使得病灶部位與正常部位之間的邊界更為清晰[2]。目前，最常用的MRI造影劑是釓離子螯合物，應(yīng)用于T1加權(quán)成像，能夠縮短氫質(zhì)子在外加磁場(chǎng)下的縱向弛豫率[3]。但是，這種離子型造影劑的分布明顯受到血流量影響，其信號(hào)增強(qiáng)的效果不僅出現(xiàn)在腫瘤部位，由炎癥、外傷所導(dǎo)致的充血水腫部位也會(huì)出現(xiàn)異常強(qiáng)化的高信號(hào)[4，5]。病灶的非特異強(qiáng)化使得傳統(tǒng)釓基造影劑難以區(qū)分某些惡性腫瘤和良性疾病。此外，F(xiàn)DA曾報(bào)道含釓造影劑可以在體內(nèi)沉積，不僅能夠損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)，還可以誘發(fā)腎源性系統(tǒng)纖維化，甚至造成死亡等不良后果[6]。這些潛在風(fēng)險(xiǎn)已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注，因此， 新的MRI造影劑的研制成為目前的研究熱點(diǎn)。

為了獲得更精確的診斷信息、構(gòu)建有響應(yīng)性成像能力的造影劑，腫瘤微環(huán)境的影響不容忽視。腫瘤微環(huán)境與正常組織之間差異很大，腫瘤內(nèi)部組織代謝快，因此造成酸性物質(zhì)堆積、乏氧狀態(tài)及H2O2富集等[7，8]。其中，針對(duì)腫瘤微環(huán)境內(nèi)低pH值響應(yīng)的MRI造影劑引起了研究者的廣泛關(guān)注，因?yàn)楦鞣N類型以及不同分期的腫瘤，內(nèi)部都呈現(xiàn)酸性[9～13]。近幾年，以MnO2納米殼作為一種理想的pH響應(yīng)T1加權(quán)MRI造影劑越來(lái)越受到關(guān)注，因?yàn)镸nO2納米殼在腫瘤酸性環(huán)境下可以分解為順磁性的Mn2+，使得T1信號(hào)增強(qiáng)[14～16]。另一方面，即使MnO2納米殼在血流量豐富的非腫瘤部位聚集，也不會(huì)引起相應(yīng)部位的信號(hào)異常增高，因此提高了造影劑的靈敏度和特異性。然而，單一模態(tài)的T1加權(quán)MRI并不能提供全面的診斷信息，如果融合其它的影像手段，如US、DR、CT或者PET，由于成像模式和成像機(jī)制不同，造成時(shí)間及空間誤差，丟失大量有用信息[17]。構(gòu)建pH響應(yīng)T1/T2成像MRI造影劑可以實(shí)現(xiàn)在單一設(shè)備上的雙模態(tài)成像，彌補(bǔ)上述不足。

本研究成功構(gòu)建了聚丙烯酸（PAA）修飾的Fe3O4@MnO2殼-核結(jié)構(gòu)，以Fe3O4為核心， MnO2為納米殼，形成了具有良好穩(wěn)定性的Fe3O4@MnO2@PAA納米造影劑。這種新型的pH響應(yīng)T1/T2雙模態(tài)MRI造影劑可以實(shí)現(xiàn)在腫瘤微環(huán)境中產(chǎn)生順磁性Mn2+，增強(qiáng)T1信號(hào); 此外，F(xiàn)e3O4能夠在T2加權(quán)像上更好地區(qū)分腫瘤與正常組織之間的邊界，提供更準(zhǔn)確的信息。更重要的是，F(xiàn)e3O4@MnO2@PAA納米粒子在近紅外區(qū)具有優(yōu)異的吸收性質(zhì)，因此具備良好的光熱轉(zhuǎn)換性能。這些優(yōu)良的特性使得Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子有望成為一種有良好發(fā)展前景的納米診療劑。

2?實(shí)驗(yàn)部分

2.1?儀器與試劑

Bruker Vertex 70 光譜儀、D8 Foucs粉末X線衍射儀（德國(guó)布魯克公司）S-4800場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（日本日立司株式會(huì)社）; G2-F20場(chǎng)發(fā)射透射電鏡（美國(guó)FEI公司）; iCAP6300電感耦合等離子體-發(fā)射光譜儀（美國(guó)賽默飛世爾公司）; Aglient Gary 60紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)瓦里安公司）; 808 nm激光器（中國(guó)海特光電有限公司）; 3.0 T Discovery MR750 w核磁共振儀（美國(guó)通用電氣公司）; Bruker 400 MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀（瑞士布魯克拜厄斯賓公司）; Zeta電位測(cè)試儀（英國(guó)馬爾文公司）; FLIR T420近紅外熱成像照相機(jī)（美國(guó)福祿克公司）。

FeCl3·6H2O、KMnO4、乙酸鈉（NaAc）、乙醇、乙二醇，乙二胺、聚丙烯酸（PAA）、聚烯丙胺鹽酸鹽（PAH）和2-（N-嗎啉）乙磺酸（MES）購(gòu)于上海麥克林生化試劑公司; 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8試劑盒）購(gòu)自大連美倫生物技術(shù)有限公司。所用試劑均為分析純。

2.2?實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1?Fe3O4納米粒子的制備?參照文獻(xiàn)[18]的方法構(gòu)建粒徑均一的磁性Fe3O4納米粒子。首先，將40 mL乙二醇、20 mL乙二胺混合攪拌10 min，然后加入2.0 g FeCl3·6H2O和6.0 g NaAc，劇烈攪拌1 h， 將混合溶液移入100 mL的水熱反應(yīng)釜，200℃反應(yīng)24 h，得到Fe3O4納米粒子，用乙醇、去離子水反復(fù)洗凈，分散在去離子水中，待用。

2.2.2?Fe3O4@MnO2納米粒子的制備?參照文獻(xiàn)[19]的方法合成Fe3O4@MnO2納米粒子。首先，將制備的Fe3O4納米粒子（10 mmol/L， 10 mL）分散在100 mL MES緩沖溶液（0.1 mol/L， pH 6.0）中，混勻后，在超聲下加入KMnO4（10 mmol/L， 25 mL），反應(yīng)40 min，將得到的棕黑色沉淀物用去離子水洗凈。

2.2.3?PAA修飾Fe3O4@MnO2納米粒子的制備?采用層層自組裝方法[20]?在Fe3O4@MnO2納米粒子表面修飾PAA。首先，將攜帶負(fù)電荷的Fe3O4@MnO2納米粒子用攜帶正電荷的聚合物PAH包裹，然后用帶負(fù)電荷的陰離子聚合物PAA再次包裹，所形成的Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子具有良好的分散性。

2.2.4?活體實(shí)驗(yàn)?Balb/c小鼠（18～23 g）購(gòu)自于長(zhǎng)春億思實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技公司。在小鼠后腿前方皮下注射4T1細(xì)胞，建立腫瘤模型，待腫瘤體積達(dá)到80～110 mm3可以用于實(shí)驗(yàn)測(cè)試。所有的動(dòng)物操作均按照中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物條例進(jìn)行，并獲得倫理審批。

2.2.5?細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)?應(yīng)用CCK-8試劑盒評(píng)價(jià)Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子的細(xì)胞毒性。將人類乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，在37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)24 h。加入不同濃度的Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子（0～200 μg/mL， 100 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)，測(cè)定吸光度。

2.2.6?體外及體內(nèi)的磁共振檢測(cè)?Mn2+和Fe3O4納米粒子分別具有T1加權(quán)像和T2加權(quán)像的MRI效果，應(yīng)用3.0 T臨床MRI掃描儀評(píng)價(jià)Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子的成像效果。首先，將Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子按照不同濃度梯度分散在不同pH值的PBS緩沖溶液中，分別設(shè)置pH 5.0 和7.4兩種條件模擬腫瘤內(nèi)部的酸性環(huán)境和人體的正常組織環(huán)境。Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子的濃度通過(guò)ICP原子發(fā)射光譜法測(cè)定，分別為Mn2+：0～0.32 mmol/L， Fe3O4： 0～1.4 mmol/L。

體內(nèi)MRI測(cè)試采用Balb/c小鼠進(jìn)行，荷瘤小鼠麻醉下通過(guò)尾靜脈注入不同濃度的Fe3O4@MnO2@PAA NPs （400 μg/mL，150 μL），在不同的時(shí)間點(diǎn)（0、1、2、3、5、12、24、48 和 96 h）記錄小鼠腫瘤部位的T1和T2圖像。以400 μg/mL的濃度對(duì)Balb/c荷瘤小鼠進(jìn)行瘤內(nèi)注射，并獲得腫瘤部位注射前后的圖像。T1加權(quán)掃描的圖像參數(shù)：TR=569 ms， TE=20.7 ms， FOV=200 × 200 mm。T2加權(quán)掃描的圖像參數(shù)：TR=7279.8 ms， TE=115 ms， FOV=240 × 240 mm。

2.2.7?體內(nèi)光熱成像測(cè)試?荷瘤小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組采用Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子 （800 μg/mL， 0.15 mL）瘤內(nèi)注射，空白對(duì)照組采用相同體積的PBS緩沖液瘤內(nèi)注射。然后，對(duì)每只小鼠的腫瘤部位進(jìn)行808 nm近紅外光照（1.3 W/cm2， 10 min），用紅外照相機(jī)記錄腫瘤部位的溫度變化。

2.2.8?細(xì)胞光熱治療?MCF-7細(xì)胞接種細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，保證細(xì)胞貼壁，然后加入不同濃度的Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子（0～400 μg/mL） 繼續(xù)培養(yǎng)3 h。用808 nm激光（1.3 W/cm2）照射每個(gè)孔10 min，用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活情況。

3?結(jié)果與討論

3.1?Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子的表征

采用溶劑熱方法合成了Fe3O4納米粒子，對(duì)其進(jìn)行SEM和TEM掃描，可見(jiàn)此納米粒子呈較均勻的球體，直徑約45 nm（圖1A）。與KMnO4反應(yīng)后，在Fe3O4表面成功生成了MnO2殼，透射電鏡的檢測(cè)結(jié)果顯示殼厚度約為25 nm（圖1B）。如圖1C～1F所示，通過(guò)HAADF-STEM能譜掃描元素分布可知，納米粒子中的Fe元素均勻分布在核心區(qū)域，Mn元素位于表面，而O元素分布于整個(gè)納米粒子中，證實(shí)了Fe3O4@MnO2的殼-核結(jié)構(gòu)。XRD表征結(jié)果中，位于36.8°和65.8°的峰位再次證明了MnO2殼的存在（圖2A）[21]。為了提高Fe3O4@MnO2納米粒子的分散性和生物相容性，采用攜帶不同電荷的聚合物對(duì)其進(jìn)行修飾，Zeta電位測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖2B，F(xiàn)e3O4@MnO2， Fe3O4@MnO2@PAH， Fe3O4@MnO2@PAA 表面的電位分別為15.5 mV、+16.3 mV和11.3 mV，證實(shí)納米粒子表面覆蓋了聚合物涂層。

Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子在近紅外區(qū)有較強(qiáng)的吸收（圖3A），具有作為腫瘤光熱治療介質(zhì)的潛能。為了進(jìn)一步探究其光熱性能，將不同濃度的Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子置于808 nm波長(zhǎng)的激光器下進(jìn)行照射（1.3 W/cm2， 10 min）。照射期間，F(xiàn)e3O4@MnO2@PAA 納米粒子水溶液（400 μg/mL） 的溫度從23.2℃上升至54.4℃，溫度上升曲線如圖3B所示，值得注意的是，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下，去離子水的溫度變化并不明顯，說(shuō)明Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子在照射過(guò)程中將光能轉(zhuǎn)換為熱能并釋放出來(lái)。這種良好的光熱轉(zhuǎn)換能力表明Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子具備腫瘤光熱治療的性能。

3.2?細(xì)胞毒性

細(xì)胞毒性是評(píng)價(jià)納米材料能否應(yīng)用于生物體內(nèi)的重要指標(biāo)。采用CCK-8試劑盒檢測(cè)Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子的毒性。將MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子（6.25～200 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞存活率均在90%以上（圖4），其結(jié)果證實(shí)Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子無(wú)明顯細(xì)胞毒性，可用于進(jìn)一步的pH響應(yīng)T1/T2雙模態(tài)成像及腫瘤光熱治療。

3.3?pH響應(yīng)的MRI體外成像

為了評(píng)價(jià)Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子作為pH響應(yīng)的T1/T2雙模態(tài)MRI造影劑的成像能力，選擇pH 7.4的納米粒子溶液模擬正常組織內(nèi)環(huán)境，選擇pH 5.0的納米粒子溶液模擬腫瘤微環(huán)境，并采用3.0 T的醫(yī)用核磁共振儀進(jìn)行檢測(cè)，影像結(jié)果如圖5A及5B所示。MnO2納米殼在pH 7.4和5.0的不同條件下，成像效果差異顯著，正常體內(nèi)環(huán)境下的MnO2納米殼穩(wěn)定性較好，沒(méi)有產(chǎn)生增強(qiáng)效果。在酸性環(huán)境下，MnO2納米殼發(fā)生解離，釋放出順磁性的Mn2+，產(chǎn)生明顯的T1強(qiáng)化信號(hào)。隨著Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子濃度增加，F(xiàn)e3O4由于內(nèi)在的固有磁性，并沒(méi)有受到pH值改變的影響，在兩組pH條件下都顯示了優(yōu)異的T2增強(qiáng)效果，從另一個(gè)側(cè)面證實(shí)了Fe3O4核比較穩(wěn)定，不會(huì)受到pH值的明顯影響。為了量化評(píng)估納米粒子的強(qiáng)化能力，應(yīng)用超導(dǎo)磁共振波譜儀測(cè)量造影劑的弛豫值，如圖5C及5D所示，在pH 5.0的條件下，其納米殼分解為順磁性的Mn2+，縱向弛豫值（r1）為9.456 L/（mmol s），具有良好的縱向弛豫率。此外，F(xiàn)e3O4納米粒子的橫向弛豫值（r2）為162.32 L/（mmol s）。以上數(shù)據(jù)表明， Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子具有優(yōu)異的核磁成像效果及弛豫率。

3.4?pH響應(yīng)的活體成像

進(jìn)一步探究了Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子在小鼠活體內(nèi)的成像效果。荷瘤小鼠麻醉后先進(jìn)行T1、T2加權(quán)像MRI掃描，將圖像作為陰性對(duì)照，隨后在腫瘤部位瘤內(nèi)注射Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子。如圖6A和6B所示，腫瘤部位在T1加權(quán)像的亮度明顯增加，T2加權(quán)像的亮度明顯減低，證實(shí)瘤內(nèi)原位注射具有較好的T1及T2加權(quán)像效果。為了評(píng)估造影劑在體內(nèi)是否具備MR雙模態(tài)成像能力，將Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子經(jīng)小鼠尾靜脈注射，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行MRI掃描，結(jié)果如圖7所示，在注射后的96 h內(nèi)腫瘤部位T1信號(hào)的亮度逐漸增加，T2信號(hào)的亮度逐漸變暗，與注射前陰性對(duì)照相比均發(fā)生變化。此外，如圖8所示，小鼠肝臟MRI信號(hào)在注射給藥前后也發(fā)生了變化，隨著時(shí)間推移，肝臟信號(hào)在T2加權(quán)像上逐漸變黑，表明Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子隨血液循環(huán)流經(jīng)肝臟，并逐漸被肝細(xì)胞攝取。

3.5?光熱成像及治療

進(jìn)一步研究Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子光熱成像及治療效果。隨機(jī)選擇兩組荷瘤小鼠，實(shí)驗(yàn)組在腫瘤部位注射Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子，空白對(duì)照組注射PBS緩沖溶液。如圖9A所示，在相同條件下，經(jīng)808 nm激光（1.3 W/cm2， 10 min）照射后，空白對(duì)照組溫度無(wú)明顯上升，而實(shí)驗(yàn)組腫瘤部位的溫度上升20℃，達(dá)到了殺死腫瘤細(xì)胞的有效溫度。為了評(píng)估其腫瘤細(xì)胞光熱治療效果，將材料與細(xì)胞培養(yǎng)基混合后孵育MCF-7細(xì)胞，用808 nm激光（1.3 W/cm2， 10 min）照射所有細(xì)胞。如圖9B所示，與空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞死亡率隨Fe3O4@MnO2@PAA 納米粒子的濃度增高而上升，表明此納米粒子具備腫瘤細(xì)胞的光熱治療能力。

4?結(jié) 論

成功合成了Fe3O4@MnO2@PAA的殼-核結(jié)構(gòu)，此納米材料具備pH響應(yīng)T1/T2雙模態(tài)MRI介導(dǎo)腫瘤光熱治療的功能。Fe3O4核賦予了Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子的磁共振T2成像能力，MnO2納米殼具有pH調(diào)控的T1加權(quán)成像能力。同時(shí)， Fe3O4@MnO2@PAA納米粒子在近紅外區(qū)的吸收能力，使其具有良好的光熱性能，能夠達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的目的。這種pH響應(yīng)T1/T2雙模態(tài)MRI介導(dǎo)光熱治療的納米診療劑有良好的發(fā)展前景，為腫瘤的診斷和治療提供了新的思路和方法。

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