鐘勇，但衛(wèi)斌，謝俊杰，劉江勇，邵志雄，易峰濤，鄧波

(1.湖北省通城縣人民醫(yī)院腫瘤科，咸寧 437400； 2.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院放射治療科，武漢 430070；3.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院放射科，武漢 430070；4.湖北省咸寧市中心醫(yī)院腫瘤中心，咸寧 437000)

原發(fā)性肝癌是我國第四常見的惡性腫瘤，在腫瘤相關(guān)致死病因中排名第三，嚴(yán)重威脅人民的健康和生命[1-2]。過去考慮全肝耐受放射劑量較低、放射線對于周圍正常組織的影響，很難提高肝臟腫瘤的靶區(qū)放射劑量，所以放射治療(放療)在肝癌治療中的應(yīng)用有限。近年來，隨著對放射生物學(xué)及放射物理學(xué)的不斷認(rèn)識、放療技術(shù)及設(shè)備的不斷發(fā)展，使放療在肝癌治療中的應(yīng)用更加廣泛。但腫瘤的輻射抗性以及大劑量照射對正常肝組織的損傷仍然是肝癌放療中難以突破的瓶頸。重樓是我國傳統(tǒng)中藥，具有清熱解毒、涼肝定驚、消腫鎮(zhèn)痛等功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)它具有抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等功效[3]。重樓總皂苷(Rhizomaparidistotal saponins，RPTS)是重樓的主要成分，研究發(fā)現(xiàn)它對骨肉瘤、乳腺癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種實體瘤均具有一定的抗腫瘤作用，其機(jī)制主要與細(xì)胞毒性作用、免疫調(diào)節(jié)作用、抑制腫瘤血管生成、降低腫瘤細(xì)胞耐藥性等有關(guān)[4-6]。目前關(guān)于RPTS抗肝癌作用的研究時有報道，但有關(guān)其對肝癌細(xì)胞放射敏感性影響的研究尚不多見。因此，筆者擬通過觀察RPTS對肝癌HepG2細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡情況的影響，并進(jìn)一步研究其對肝癌細(xì)胞中MUC-1蛋白表達(dá)情況的影響，從而探討RPTS對肝癌細(xì)胞放射敏感性的影響及其可能機(jī)制，為探索中醫(yī)藥在肝癌放療中的應(yīng)用、增強(qiáng)肝癌放療療效提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗藥品及試劑 RPTS由成都曼思特生物科技有限公司(批號：A0125，含量≥98%)提供，實驗前用二甲亞砜(DMSO)配制成一定濃度的保存液，保存于-20 ℃條件下，實驗時用小劑量伊格爾培養(yǎng)液(MEM)配制成不同濃度的藥液。CCK-8試劑盒(C0038)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；碘化丙啶(PI)染色試劑盒(PAB180014)及Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒(PAB180012)均購自bio-Swamp公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0010S)購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠抗MUC-1抗體[C595(NCRC48)]購自Abcam公司。

1.2細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng) 肝癌HepG2細(xì)胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)，用MEM Hyclone培養(yǎng)基、10%胎牛血清、青霉素-鏈霉素溶液配置成的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，實驗時取對數(shù)生長期細(xì)胞備用。

1.3照射方法 采用瑞典醫(yī)科達(dá)直線加速器(規(guī)格型號：ELEKTA-Precise)6 MV X線進(jìn)行照射。設(shè)照射野大小為16 cm×16 cm，采用設(shè)源皮距(SSD)照射技術(shù)，SSD為100 cm，板緣距離射野邊緣約2 cm，劑量率為200 cGy·min-1，照射劑量設(shè)為單次8 Gy。

1.4CCK-8法檢測RPTS對HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用 取指數(shù)生長期細(xì)胞，配制成4×103個·mL-1的單細(xì)胞懸液，保持每孔100 μL接種于96孔板中，復(fù)孔3個，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，再給予不同濃度的RPTS(0.0，30，60，120，240 μg·mL-1)干預(yù)細(xì)胞，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，每個96孔板邊緣均加入磷酸鹽緩沖液(PBS)100 μL，再分別繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72 h。然后吸出原液，PBS洗滌1次，每孔中加入用MEM稀釋的CCK-8 100 μL，再置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育3 h。用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法測定每孔在波長450 nm處吸光度(A值)，再根據(jù)公式計算細(xì)胞增殖抑制率。實驗重復(fù)3次。細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(用藥組A值-空白組A值)/(陰性組A值-空白組A值)]×100%。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期變化及細(xì)胞凋亡情況 取對數(shù)生長期細(xì)胞，清洗消化后制成3×105個·mL-1的單細(xì)胞懸液，接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后再分別設(shè)空白對照組、RPTS組、單純照射組、照射+RPTS組?？瞻讓φ战M：用正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h；RPTS組：用低細(xì)胞毒性濃度的RPTS(25 μg·mL-1)干預(yù)48 h；單純照射組：先用正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h，再用6 MV的X線進(jìn)行照射；照射+RPTS組：先用低細(xì)胞毒性濃度的RPTS(25 μg·mL-1)干預(yù)48 h，再用6 MV的X線進(jìn)行照射。照射完成后用PBS洗滌2次，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，并重懸于Binging Buffer 200 μL中，再根據(jù)PI染色試劑盒及Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒的說明書進(jìn)行細(xì)胞染色，最后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布及凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

1.6Western blotting檢測MUC-1蛋白表達(dá)情況 細(xì)胞培養(yǎng)和分組方法同“1.5”項。照射完成后收集細(xì)胞并提取蛋白，再根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書測定各組蛋白的含量，每組樣品各取蛋白30 μg進(jìn)行上樣，根據(jù)Western blotting法操作步驟檢測各組中MUC-1蛋白的表達(dá)情況。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1RPTS抑制HepG2細(xì)胞增殖 與空白對照組比較，RPTS能明顯抑制HepG2細(xì)胞增殖，其抑制率隨藥物濃度的增加、作用時間的延長明顯增大。見圖1。

2.2RPTS對細(xì)胞周期的影響 RPTS可影響HepG2細(xì)胞的周期分布，減少G0/G1期細(xì)胞分布率，將細(xì)胞阻滯于S期(t=16.4136，P<0.05)；在RPTS干預(yù)細(xì)胞48 h后再進(jìn)行細(xì)胞照射，S期細(xì)胞明顯減少(t=13.4513，P<0.05)，而G0/G1期以及G2/M期細(xì)胞變化不顯著。見表1。

圖1 RPTS對HepG2細(xì)胞生長抑制曲線

Fig.1GrowthinhibitioncurveofRPTSonHepG2cells

表1 4組HepG2細(xì)胞作用48 h后細(xì)胞周期分布情況

組別G0/G1期S期G2/M期空白對照組77.19±2.4911.09±0.5511.72±1.95RPTS組49.8±6.5535.07±2.4715.12±5.04單純照射組85.90±4.9211.40±3.372.70±1.58照射+RPTS組88.74±1.075.62±0.445.64±1.05

2.3RPTS對HepG2細(xì)胞凋亡的影響 與空白對照組比較，RPTS組在RPTS(25 μg·mL-1)干預(yù)HepG2細(xì)胞48 h后，早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著增加(t早期=18.700 9，t晚期=34.159 9，P<0.01)；與RPTS組比較，單純照射組及照射+RPTS組早期凋亡率和晚期凋亡率明顯增加(t早期=53.565 4，t晚期=2.890 1，P<0.05)。見表2。

表2 4組HepG2細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡變化情況

組別正?；罴?xì)胞凋亡早期細(xì)胞空白對照組99.72±0.260.10±0.14RPTS組92.43±0.554.07±0.34單純照射組92.14±0.484.20±0.21照射+RPTS組83.50±0.6011.68±0.12組別凋亡晚期細(xì)胞死亡細(xì)胞空白對照組0.00±0.000.18±0.31RPTS組3.35±0.180.15±0.05單純照射組3.51±0.250.16±0.07照射+RPTS組4.61±0.610.21±0.03

2.4RPTS對MUC-1蛋白表達(dá)的影響 RPTS+照射組MUC-1蛋白的表達(dá)最低，呈現(xiàn)時間依賴性(t48 h=5.1187，t72 h=4.3864，P<0.05)；而RPTS組MUC-1蛋白的表達(dá)也明顯低于空白對照組，并呈時間依賴性(t48 h=5.5388，t72 h=5.2705；P<0.05)。見圖2。

A.空白對照組(48 h)；B.空白對照組(72 h)；C.RPTS組(48 h)；D.RPTS組(72 h)；E.單純照射組(48 h)；F.單純照射組(72 h)；G.照射+RPTS組(48 h)；H.照射+RPTS組(72 h)

圖2 4組HepG2細(xì)胞在48和72 h MUC-1蛋白表達(dá)

A.blank control group(48 h)；B.blank control group(72 h)；C.RPTS group(48 h)；D.RPTS group(72 h)；E.irradiation group(48 h)；F.irradiation group(72 h)；G.irradiation+RPTS group(48 h)；H.irradiation+RPTS group(72 h)

Fig.2ProteinexpressionofMUC-1infourgroupsofHepG2cellsat48hand72h

3 討論

根據(jù)原發(fā)性肝癌診療規(guī)范，對伴有門靜脈/下腔靜脈癌栓或肝外轉(zhuǎn)移的Ⅲa期、Ⅲb期肝癌患者，可行姑息性放療；部分患者術(shù)前放療可使腫瘤體積縮小或降期，而獲得手術(shù)切除機(jī)會[7-9]；而肝外轉(zhuǎn)移的患者，也可用于等待肝癌肝移植前的治療，或用于減輕疼痛、梗阻或出血等癥狀，使腫瘤發(fā)展減緩，從而延長生存期[10-12]；而中央型肝癌切緣距腫瘤≤1 cm的窄切緣術(shù)后需要行輔助放療降低復(fù)發(fā)概率[13]。

雖然放療在肝癌治療中的應(yīng)用日趨廣泛，但是腫瘤的輻射抗性以及大劑量射線照射對正常組織的損傷仍然是肝癌放療中難以突破的瓶頸。肝細(xì)胞對放射線存在顯著的劑量-體積效應(yīng)，其放射耐受量、再生能力與照射體積-劑量、肝臟的功能狀態(tài)密切相關(guān)[14]。肝功能為Child-Pugh A級時，在常規(guī)分割放療下，全肝的耐受劑量為28～30 Gy[15]，在非常規(guī)低分割放療(每次分割劑量4～8 Gy)下，全肝的耐受量為23 Gy[16]；肝功能為Child-Pugh B級時，肝臟對射線的耐受量明顯下降。考慮到亞洲PLA患者常伴有肝硬化和脾功能亢進(jìn)，導(dǎo)致胃腸道瘀血和凝血功能差，所以放射耐受劑量更低于臨床推薦劑量[17]。而肝臟腫瘤的放療劑量與低分化鱗癌(如鼻咽癌)相近，致死量約為60 Gy/6周，所以正常肝組織的耐受劑量遠(yuǎn)低于致死量[18]。因此，尋找高效低毒的放射增敏劑是目前肝癌放射治療的一個研究熱點。

中藥具有多靶點、多效性的特點，其毒副作用較低，在改善放療敏感性方面有其自身的特點，作為放療輔助用藥已廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的防治。許多活血化瘀類中藥能通過改善血液循環(huán)及組織供氧來實現(xiàn)放療的增敏作用，如莪術(shù)油、川芎嗪、川紅注射液、通竅活血湯等中藥制劑，通過擴(kuò)張血管、增加血流、改善微循環(huán)、破壞腫瘤組織周圍和內(nèi)部纖維蛋白的聚集、降低血液黏稠度、減輕血管閉塞等作用，提高瘤體的氧效值，改善乏氧細(xì)胞放射敏感性[19-20]。而部分中藥提取物則通過增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞DNA的損傷、抑制乏氧細(xì)胞損傷的修復(fù)來起到增敏作用，如在乏氧條件下，馬藺子甲素可明顯降低HeLa細(xì)胞中谷胱甘肽含量，抑制DNA的合成和DNA鏈斷裂后的重接修復(fù)，從而起到放射增敏作用[21]；另外一些中藥提取物則可以通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周期，從而提高放射敏感性，如β-欖香烯可以提高H460癌細(xì)胞株G2/M期細(xì)胞比例，從而起到放療增敏作用[22]；還有一些補(bǔ)益固本類中藥提取物則能通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)DNA分子損傷、抑制腫瘤細(xì)胞增殖來實現(xiàn)放療增敏，如人參皂苷Rg3能通過抑制細(xì)胞活性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及DNA分子損傷來實現(xiàn)對食管癌細(xì)胞的放療增敏[23]。

根據(jù)實驗結(jié)果可知，RPTS能抑制HepG2細(xì)胞的增殖，且在一定范圍內(nèi)具有時間和濃度依賴性。從細(xì)胞周期分布情況可知，低細(xì)胞毒性的RPTS能使HepG2細(xì)胞周期分布發(fā)生改變；而低細(xì)胞毒性的RPTS可協(xié)同X線進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，這說明改變細(xì)胞周期分布、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能是RPTS發(fā)揮抗腫瘤作用、提高肝癌細(xì)胞放射敏感性的一個重要機(jī)制。

MUC-1蛋白是一種在大部分腫瘤細(xì)胞中都過量表達(dá)的糖蛋白，它與腫瘤血管生成、增殖、轉(zhuǎn)移、以及新陳代謝在內(nèi)的諸多方面都關(guān)系密切[24-28]。MUC-1基因作為原發(fā)性肝癌的致癌基因，已被發(fā)現(xiàn)具有加速肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散的能力[29]，而JAK/STAT信號通路對肝癌細(xì)胞的生長增殖起著至關(guān)重要的作用[30]，抑制STAT3信號通路能增加肝癌細(xì)胞的輻射誘導(dǎo)凋亡[31]。筆者前期的研究也發(fā)現(xiàn)[32]，MUC-1蛋白能通過激活JAK2/STAT3信號通路提高肝癌細(xì)胞的放射抵抗性；而MUC-1蛋白通過JAK2/STAT3信號通路以及抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-xL的誘導(dǎo)作用抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。這意味著降低MUC-1蛋白的表達(dá)可能是提高肝癌放療敏感性的一個潛在靶點。在本實驗中，RPTS能單獨抑制HepG2細(xì)胞中MUC-1蛋白的表達(dá)，而當(dāng)RPTS與X線聯(lián)合應(yīng)用，則能進(jìn)一步抑制MUC-1蛋白的表達(dá)，說明RPTS可協(xié)同X線進(jìn)一步抑制MUC-1蛋白的表達(dá)