熊璐琪，趙博欣

(1.廣東省惠州市中心人民醫(yī)院藥學(xué)部，惠州 516001；2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510515)

作為一種影響核酸合成的細(xì)胞毒類(lèi)藥物，氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)至今仍廣泛應(yīng)用于頭頸部腫瘤、消化道腫瘤、乳腺癌、肺癌等的治療。其主要不良反應(yīng)包括腹瀉、黏膜炎、口腔炎、惡心、嘔吐以及骨髓抑制等。從藥物代謝角度考慮，多種藥物代謝酶在5-FU的代謝解毒和代謝活化中起重要作用[1]，因此其藥動(dòng)學(xué)存在明顯的個(gè)體差異。然而，有文獻(xiàn)報(bào)道，其血藥濃度與不良反應(yīng)之間有很強(qiáng)相關(guān)性[2-3]。一項(xiàng)隨機(jī)Ⅲ期臨床試驗(yàn)顯示，依據(jù)藥動(dòng)學(xué)指標(biāo)調(diào)整5-FU劑量，明顯提高療效并降低不良反應(yīng)發(fā)生率，隨訪結(jié)果顯示患者總生存獲益[4]。

卡培他濱作為一種5-FU前體藥物，經(jīng)胃腸道給藥后，在體內(nèi)活化為5-FU從而發(fā)揮抗腫瘤的作用[5]。由于腫瘤組織中胸腺嘧啶脫氧核苷酸磷酸化酶顯著多于正常組織，使得該藥有一定的靶向性。鑒于卡培他濱在體內(nèi)代謝過(guò)程中的復(fù)雜性，加之其與5-FU具有相類(lèi)似的最終代謝過(guò)程，卡培他濱同樣表現(xiàn)出較大的個(gè)體差異。然而，筆者尚未見(jiàn)依據(jù)卡培他濱藥動(dòng)學(xué)參數(shù)來(lái)個(gè)體化調(diào)整給藥劑量從而改善患者臨床收益的相關(guān)系統(tǒng)性研究。

為了獲得臨床患者卡培他濱的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，高效快速的定量方法是其重要的關(guān)鍵技術(shù)。國(guó)外雖有采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法測(cè)定卡培他濱及其代謝產(chǎn)物報(bào)道，國(guó)內(nèi)卻鮮有相關(guān)研究。不僅如此，現(xiàn)有報(bào)道的方法由于存在樣本預(yù)處理過(guò)于繁冗，檢測(cè)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，定量限過(guò)高，重復(fù)性差等不足，難以在臨床實(shí)踐中開(kāi)展。因此，筆者采用親水性液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(hydrophilic liquid chromatography series mass spectra，HILIC-LC-MS/MS)方法快速定量卡培他濱及其活性代謝產(chǎn)物，旨在為臨床提供更加高效、快速、簡(jiǎn)潔的定量方法，以便為臨床針對(duì)此類(lèi)藥物相關(guān)的個(gè)體化精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent1260 液相色譜-G6460三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(G1312B型四元輸液泵，G367E型自動(dòng)進(jìn)樣器，G1316A型柱溫箱，G1322A型脫氣機(jī))色譜工作站：(B.04.01 SP2)，P13110S 電子天平(德國(guó)Sartotins公司，感量：0.1 mg)；Centrifuge 5810R高速離心機(jī)(美國(guó)Eppendorf公司)。

1.2試藥 卡培他濱對(duì)照品(批號(hào)：ZZS17010904)、5-FU對(duì)照品(批號(hào)：ZZS17010908)均購(gòu)于上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；乙腈、甲酸、乙酸銨為色譜純，其他化學(xué)試劑均為化學(xué)純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 色譜柱為Agilent Poroshell 120 Hilic (2.1 mm×50 mm，2.7 μm)； 流動(dòng)相為乙腈- 25 mmol·L-1乙酸銨溶液(含0.1%甲酸)(95：5)；流速：0.3 mL·min-1； 柱溫30 ℃。

2.2質(zhì)譜條件 離子源為電噴霧離子源(ESI源)；Vcap 毛細(xì)管電壓4 000 V；干燥器溫度340 ℃；離子源霧化器(N2)，流量：9 L·min-1； 霧化氣壓力241.325 kPa?？ㄅ嗨麨I和5-FU的碰撞能分別為-13 eV和-17 eV；裂解電壓均為7 V。

2.3工作液及質(zhì)量控制樣品的制備 精密稱(chēng)取卡培他濱及5-FU適量，并溶解于乙腈中，分別制成濃度為400及750 μg·mL-1的儲(chǔ)備液。將儲(chǔ)備液用乙腈連續(xù)稀釋制成含兩種成分濃度為390.625，781.25，1562.5，3125，6250，12 500，25 000，50 000及100 000 ng·mL-1的混合工作液。用儲(chǔ)備液以同樣方法單獨(dú)稀釋成濃度為781.25，6250，50 000 ng·mL-1的高、中、低濃度質(zhì)量控制樣品。所有溶液均保存于4 ℃環(huán)境中，使用前室溫放置復(fù)溫。

2.4血漿樣品的處理 取血漿樣品100 μL加入乙腈400 μL作為提取溶劑，渦旋混合1 min，低溫20 000×g離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液，取2 μL用于 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS/MS)分析。

2.5質(zhì)譜分析 應(yīng)用ESI負(fù)離子模式進(jìn)行檢測(cè)?？ㄅ嗨麨I在全掃描的模式下，母離子為358.1(M-H)具有很高的液質(zhì)響應(yīng)值，其他雜質(zhì)不干擾母離子的測(cè)定。進(jìn)行子離子掃描時(shí)，當(dāng)裂解電壓為130 V，碰撞能為13 eV時(shí)，卡培他濱主要離子碎片為m/z=154.1。5-FU在全掃描的模式下，母離子的碎片為m/z=129(M-H)，在多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)模式下，子離子的碎片為m/z=42.1，碰撞能為17 eV，裂解電壓為90 V時(shí)，響應(yīng)值最穩(wěn)定，卡濱他濱及5-FU的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖1，MRM圖見(jiàn)圖2。

2.6方法專(zhuān)屬性 分別取6份不同來(lái)源不含相關(guān)檢測(cè)藥物的人空白血漿，按“血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)。結(jié)果表明，空白血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物卡培他濱及5-FU的測(cè)定。并且在樣品的檢測(cè)時(shí)無(wú)雜峰干擾。見(jiàn)圖3。

A.卡培他濱；B.5-FU

Fig.1Productionspectraofcapecitabineand5-fluorouracil

A.空白樣品；B.卡培他濱；C.5-FU

Fig.2MRMchromatogramofcapecitabineand5-fluorouracil

2.7標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取工作液10 μL，真空干燥后，加入空白血漿100 μL渦旋混勻，配制成最終濃度為39.062 5～10 000 ng·mL-1的含藥血漿，加入乙腈400 μL，以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物的峰面積值為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，卡培他濱的回歸方程為：Y=5.0645X+60.783，R2=0.999 3 (n=9)，5-FU的回歸方程：Y=2.651 3X+37.845，R2=0.999 2 (n=9)，方法線性范圍在39.062 5～10 000 ng·mL-1。

A.TIC；B.卡培他濱；C.5-FU

由于本方法主要適用于臨床檢測(cè)，盡管LC-MS/MS法檢測(cè)靈敏度高，但由于臨床檢測(cè)中卡培他濱及5-FU至31.25 ng·mL-1以下的意義有限，因此，本法中卡培他濱及5-FU的最低定量限均為31.25 ng·mL-1(S/N>10)。

2.8提取回收率 取空白血漿100 μL，按“2.7”項(xiàng)下方法制備低(78.125 ng·mL-1)、中(625 ng·mL-1)、高(5000 ng·mL-1)濃度的質(zhì)量控制樣品各6份，進(jìn)樣2 μL，記錄卡培他濱及5-FU峰面積A1；同時(shí)檢測(cè)(低、中、高)3種質(zhì)量控制濃度對(duì)應(yīng)檢測(cè)藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣2 μL，所得峰面積A2。血漿中提取回收率(%)=A1/A2×100%：卡培他濱低、中、高濃度提取回收率分別為(78.22±3.15)%，(75.37±2.99)%及(81.05±2.78)%，5-FU低、中、高濃度的提取回收率分別為(70.45±2.19)%，(72.56±1.68)%及(72.02±1.72)%。上述結(jié)果表明，卡培他濱及5-FU的提取前后一致性良好并且沒(méi)有濃度依賴(lài)性，提取回收率較高，適用于該方法檢測(cè)。

2.9精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 取空白血漿100 μL，按“2.7”項(xiàng)方法配制低、中、高濃度的卡濱他濱及5-FU的質(zhì)量控制樣本，測(cè)定日內(nèi)精密度以及連續(xù)測(cè)定3 d，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)進(jìn)行，計(jì)算質(zhì)量控制樣品的測(cè)得濃度，與配制濃度對(duì)照，求得本法準(zhǔn)確度與精密度。計(jì)算得準(zhǔn)確度滿(mǎn)足定量分析中90%～110%的范圍，日內(nèi)以及日間精密度均在±15%(表1)。

2.10穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按“2.7”項(xiàng)下方法配制低、中、高3個(gè)濃度含藥血漿，室溫條件下放置1和24 h后，處理樣本，與新鮮配制的儲(chǔ)備液比較；樣本處理后，1 h與24 h后進(jìn)樣分析，與新鮮配制的儲(chǔ)備液比較；分別于-20 ℃反復(fù)凍融3次和樣品預(yù)處理后室溫放置24 h，使用相同處理?xiàng)l件，比較放置后所檢測(cè)濃度是否穩(wěn)定。RE(%)=(測(cè)量濃度-理論濃度)/理論濃度×100%?？疾鞓悠返姆€(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表2，在上述考察條件下，3個(gè)濃度無(wú)顯著變化，RE均<10%，上述數(shù)據(jù)證明卡培他濱及5-FU在室溫、樣品處理、反復(fù)凍融的條件下均穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.11基質(zhì)效應(yīng) 取6種不同來(lái)源空白血漿，分為6組，每組各制備3個(gè)空白血漿樣品，按照血漿樣品提取方法進(jìn)行空白樣品提取。離心后，于每組3管溶液中分別加入低(781.25 ng·mL-1)、中(6250 ng·mL-1)或高(50 000 ng·mL-1)濃度卡培他濱及5-FU標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 μL，旋渦10 s，20 000×g離心15 min后取上清液進(jìn)樣。以此種處理方法測(cè)定的卡培他濱與5-FU峰面積與以水為替代基質(zhì)處理的相應(yīng)濃度樣品峰面積的比值計(jì)算百分比，結(jié)果表明，低、中、高濃度的卡培他濱和5-FU的基質(zhì)效應(yīng)影響百分比平均值分別為125.45%，131.10%，130.95%及118.34%，126.63%，124.08%，表明兩藥在低、中、高濃度下基質(zhì)效應(yīng)對(duì)血藥濃度測(cè)定影響程度基本一致。

2.12血漿卡培他濱及5-FU濃度檢測(cè)的臨床應(yīng)用 20例患者以卡培他濱說(shuō)明書(shū)規(guī)定劑量口服藥物1～2周，隨機(jī)抽取服藥前全血并分離血漿，對(duì)卡培他濱及5-FU的穩(wěn)態(tài)谷濃度進(jìn)行檢測(cè)?；颊呖ㄅ嗨麨I的平均血藥濃度為2802.424 ng·mL-1，分布區(qū)間為1 661.627～4 438.821 ng·mL-1；5-FU的平均血藥濃度為343.365 ng·mL-1，分布區(qū)間為133.735～674.165 ng·mL-1。以卡培他濱血藥濃度為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)患者5-FU的血藥濃度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸分析(圖4)，R2=0.1996，表明兩藥間相關(guān)性較差。因此，同時(shí)檢測(cè)卡培他濱與5-FU的血藥濃度具有較好的臨床意義。

表1 3種質(zhì)量控制濃度的日內(nèi)及日間精密度

濃度/(ng·mL-1)卡培他濱日間第1天第2天第3天日內(nèi)5-FU日間第1天第2天第3天日內(nèi)78.12574.378±2.23074.013±2.37076.156±3.24074.849±1.14775.374±1.96078.573±2.31079.354±3.03077.767±2.109625617.394±11.480624.782±9.620627.573±9.670623.250±5.260624.421±13.240621.853±12.740628.844±13.970625.039±3.53650004936.234±45.2304899.118±51.9204968.352±49.5204934.568±34.6474897.823±39.7505012.834±45.8204978.752±42.9404963.136±59.074

表2 卡培他濱及5-FU在人血漿中的穩(wěn)定性

藥品與濃度新鮮配制室溫放置1 h測(cè)定RE/%室溫放置24 h測(cè)定RE/%反復(fù)凍融1 h測(cè)定RE/%反復(fù)凍融24 h測(cè)定RE/%卡培他濱 低濃度74.842±1.97476.183±2.0451.79275.748±2.8741.21174.893±1.9390.06874.084±2.62-1.015 中濃度618.428±11.736620.312±14.1590.305618.074±11.620-0.057621.858±12.5180.555623.717±13.2900.855 高濃度5001.980±58.2104987.295±46.749-0.2944975.390±46.765-0.5325005.237±45.3740.0655041.741±52.5660.7955-FU 低濃度77.916±1.84176.018±1.991-2.4476.386±1.746-1.96474.532±2.369-4.34377.090±2.062-1.060 中濃度625.931±12.375623.641±14.159-0.366624.856±11.6e0-0.172618.243±11.354-1.228617.322±12.929-1.375 高濃度5012.364±46.2534997.452±52.443-0.2984985.563±46.737-0.5355011.756±47.560-0.0124997.432±52.467-0.298

圖4 臨床患者卡培他濱與其活性代謝產(chǎn)物5-FU血藥濃度相關(guān)性

Fig.4Correlationofplasmaconcentrationofcapecitabineand5-fluorouracilinclinicalpatients

3 討論

卡培他濱是一種新型口服氟嘧啶核苷類(lèi)似物，在體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)?-FU發(fā)揮抗腫瘤作用，由于其不良反應(yīng)相對(duì)5-FU較輕，近年來(lái)逐漸在臨床中替代5-FU使用。從生物藥劑學(xué)的角度，卡培他濱在口服給藥后約1.5 h內(nèi)達(dá)到血藥峰濃度，稍后5-FU達(dá)到峰濃度。進(jìn)入循環(huán)后，卡培他濱可廣泛分布于全身各組織當(dāng)中，其中，在消化道、肝臟、腎臟組織中的藥物濃度較高，在腦組織內(nèi)藥物濃度較低?？ㄅ嗨麨I主要在肝臟中代謝并經(jīng)腎臟排泄，尿中排泄率為80%～90%，其藥物原型的排泄率僅為3%[6]。由于卡培他濱轉(zhuǎn)化為其活性代謝產(chǎn)物需要經(jīng)過(guò)較多次的酶促反應(yīng)，且其代謝酶均存在影響其活性的SNP位點(diǎn)，因此，同時(shí)檢測(cè)卡培他濱及其活性代謝產(chǎn)物5-FU的血藥濃度對(duì)評(píng)價(jià)卡培他濱的治療效果及預(yù)測(cè)其毒副作用具有重要的臨床意義。

目前，國(guó)內(nèi)常用高效液相色譜法對(duì)卡培他濱或5-FU進(jìn)行檢測(cè)[7-8]。但由于色譜法專(zhuān)屬性差、操作步驟繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不僅增加檢驗(yàn)難度，還降低該項(xiàng)目檢測(cè)臨床開(kāi)展的適用性。而另一種主流治療藥物監(jiān)測(cè)的化學(xué)法，采用抗原抗體反應(yīng)，可檢測(cè)5-FU的血藥濃度，但尚無(wú)卡培他濱的相關(guān)試劑盒上市。而化學(xué)法的藥物濃度檢測(cè)，操作步驟亦較多，試劑盒成本較高，且抗原抗體反應(yīng)易受到內(nèi)源性物質(zhì)或相關(guān)藥物代謝產(chǎn)物的干擾，從而影響檢測(cè)的準(zhǔn)確度。而國(guó)外雖已采用LC-MS/MS法測(cè)定卡培他濱或5-FU，但分析方法存在諸多問(wèn)題。如SALVADOR等[9]使用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中卡培他濱及其代謝物的濃度，所采用的洗脫方法對(duì)色譜柱傷害大，色譜運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)，且采用固相萃取法處理樣品，操作繁瑣，成本高，耗費(fèi)大。HERMES等[10]使用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中5-FU及卡培他濱的濃度，其使用衍生化法處理樣品，雖色譜運(yùn)行時(shí)間短但樣本處理過(guò)程操作繁瑣復(fù)雜，降低分析效率的同時(shí)還增加了成本。MONTANGE等[11]報(bào)道LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定人血漿中卡培他濱及其代謝物的濃度，色譜運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)達(dá)15 min，且樣品需重復(fù)測(cè)定，樣本需要量大(一次需使用500 μL)，分析效率低，不利于臨床的應(yīng)用及推廣。TSUME等[12]采用LC-MS/MS法同時(shí)測(cè)定生物樣品中5-FU及其代謝物的濃度，所采用的方法得到5-FU的定量下限為25 ng·mL-1，靈敏度低。

本研究建立一種快速同時(shí)檢測(cè)人血漿中卡培他濱及其活性代謝產(chǎn)物5-FU的LC-MS/MS的檢測(cè)方法，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①專(zhuān)屬性強(qiáng)，采用LC-MS/MS方法在固有設(shè)備特點(diǎn)中相較其他檢測(cè)設(shè)備具有更高的檢測(cè)專(zhuān)屬性，不易受到極性類(lèi)似或結(jié)構(gòu)類(lèi)似內(nèi)源性成分或代謝產(chǎn)物的影響。②靈敏度高，采用本方法對(duì)兩種成分進(jìn)行檢測(cè)，達(dá)到在線性范圍內(nèi)小于40 ng·mL-1的檢測(cè)限，并在低濃度區(qū)間內(nèi)表現(xiàn)出較好的精密度與準(zhǔn)確度。③樣品需求少，本方法檢測(cè)中僅需血漿樣品100 μL進(jìn)行同管檢測(cè)，且檢測(cè)速度快，僅2 min即可完成1例樣品中卡培他濱及5-FU的同時(shí)檢測(cè)。④檢測(cè)方法學(xué)穩(wěn)定，精密度、穩(wěn)定性及回收率等均較為穩(wěn)定，表明該方法適用于臨床血漿樣品檢測(cè)。⑤樣本處理過(guò)程簡(jiǎn)單。

應(yīng)用建立的方法對(duì)臨床患者血漿樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，患者血漿中卡培他濱及5-FU的分布區(qū)間均較寬泛，表明卡培他濱的血藥濃度存在個(gè)體差異性，進(jìn)而其活性代謝產(chǎn)物的濃度存在較大差異?？ㄅ嗨麨I與其對(duì)應(yīng)樣品中代謝產(chǎn)物5-FU血藥濃度的相關(guān)性較差，證實(shí)卡培他濱與其活性產(chǎn)物間在代謝過(guò)程中可能存在代謝酶活性的個(gè)體差異。由于5-FU的血藥濃度對(duì)卡培他濱的臨床療效及不良反應(yīng)均有較好的指導(dǎo)意義。因此，筆者建立同時(shí)檢測(cè)卡培他濱及5-FU血藥濃度的方法，一方面可以通過(guò)5-FU的血藥濃度評(píng)價(jià)并推測(cè)服用卡培他濱進(jìn)行化療患者的臨床收益，對(duì)于濃度未在合理區(qū)間的患者及時(shí)調(diào)整劑量，另一方面同時(shí)對(duì)卡培他濱進(jìn)行檢測(cè)，可以在調(diào)整劑量過(guò)程中更確切得知不同代謝酶活性患者在卡培他濱向5-FU代謝為程中的實(shí)際生物轉(zhuǎn)化情況，從而有利于實(shí)現(xiàn)更好的臨床療效并減少不良反應(yīng)。

卡培他濱與5-FU的保留時(shí)間分別為0.610和0.611 min，若在傳統(tǒng)的HPLC條件下進(jìn)行紫外檢測(cè)，兩色譜峰將無(wú)法分離，但通過(guò)MRM檢測(cè)模式具有色譜與質(zhì)譜分離的能力，根據(jù)各自獨(dú)特的分子結(jié)構(gòu)所產(chǎn)生的母離子和碎片離子，以質(zhì)譜的高分辨能力，同時(shí)檢測(cè)不同的物質(zhì)，最終形成圖譜，通過(guò)色譜工作站(B.04.01 SP2軟件)將卡培他濱及5-FU各自的色譜圖提取出來(lái)，兩藥的含量測(cè)定結(jié)果互不干擾。

綜上所述，采用LC-MS/MS法以乙腈提取血漿樣品來(lái)同時(shí)檢測(cè)卡培他濱與5-FU的濃度，是一種具有高靈敏度、高專(zhuān)屬性、簡(jiǎn)單快捷且穩(wěn)定的檢測(cè)方法。此法能快速檢測(cè)生物樣品中卡培他濱及5-FU，適用于卡培他濱制劑相關(guān)臨床治療中的治療藥物監(jiān)測(cè)。