宋明甲，文益民，吳曉燕，柴曉亮，周建

(中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)九四○醫(yī)院1.脊柱外科；2.骨科研究所，蘭州 730050)

大豆苷元和黃酮可提高骨密度和增加骨胳礦鹽的含量，改善骨胳微觀結(jié)構(gòu)[1]，但其作用機(jī)制尚不清楚。有人通過(guò)結(jié)構(gòu)類推，黃酮類化合物具有類似于雌激素樣的結(jié)構(gòu)，所以異黃酮可能通過(guò)雌激素信號(hào)機(jī)制促進(jìn)骨形成。系列研究表明，大豆異黃酮能治療去卵巢大鼠模型的骨質(zhì)疏松癥，減少去卵巢造成的骨丟失，且對(duì)生殖器官無(wú)雌激素樣作用[2-3]，因此異黃酮通過(guò)雌激素信號(hào)途徑調(diào)節(jié)骨形成并不是其主要作用機(jī)制。前期研究表明，異黃酮通過(guò)提高一氧化氮(NO)含量發(fā)揮改善心血管疾病作用[4]。因此，筆者通過(guò)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞觀察研究黃豆苷元雜質(zhì)7-甲氧基-4’-羥基異黃酮(7-methoxy-4’-hydroxyisoflavone，MHIF)對(duì)NO/cGMP/sGC信號(hào)通路的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)大鼠，出生2 d內(nèi)，購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(甘) 2016-0006。

1.2試劑 7-甲氧基-4’-羥基異黃酮(MHIF，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100348-201102，含量：100%)，胎牛血清(蘭州榮曄生物生物公司，批號(hào)：RF-32-01)；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM，美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：11054020)；β-磷酸甘油鈉、維生素C(批號(hào)：A4403)、地塞米松(批號(hào)：D4902)、青霉素(批號(hào)：M7292)、鏈霉素(批號(hào)：V900929)，均購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；Ⅱ型膠原酶(Invitrogen公司，批號(hào)：17100-017)；sGC一抗(美國(guó)abcam公司，批號(hào)：ab155651)；PKG-1一抗(cell signaling公司，批號(hào)：#3248)；辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記二抗(北京Bioword有限公司，批號(hào)：BS10043)；BCA蛋白定量試劑盒(索萊寶生物公司，批號(hào)：F8060)；骨鈣素測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程公司，批號(hào)：H152)，一氧化氮(NO，南京建成生物工程公司，批號(hào)：A012-1)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程公司，批號(hào)：A059-2)；一氧化氮合成酶阻斷劑N-單甲基-L- 精氨酸(N-monomethyl-L-arginine，L-NMA，批號(hào)：475886)和可溶性的腺苷酸環(huán)化酶(ODQ，批號(hào)：495320)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。

1.3儀器 酶標(biāo)儀(BIoTek公司，型號(hào)：EPOCH)；離心機(jī)(湖南湘儀公司，型號(hào)：Primo R)。

1.4大鼠原代成骨細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠原代顱骨成骨細(xì)胞[4]，無(wú)菌條件下，取出生2 d內(nèi)SPF級(jí)大鼠顱骨，剔除骨膜及軟組織，將骨片剪成碎片，用0.25%胰蛋白酶于37 ℃水浴酶解2次，每次10 min，棄消化液。0.1%Ⅱ型膠原酶于37 ℃水浴連續(xù)消化4次，第1次10 min消化結(jié)束后棄掉消化液，以后每次水浴消化20 min，結(jié)束后收集消化液，加入含有10%胎牛血清DMEM終止消化，收集液200×g離心10 min，棄上清液，用含10%胎牛血清DMEM懸浮細(xì)胞沉淀。以3×104·mL-1的濃度接種培養(yǎng)中，37 ℃、5%二氧化碳(CO2)、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔3 d換液一次，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%融合時(shí)傳代培養(yǎng)。

1.5成骨細(xì)胞的藥物處理 待成骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)融合生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%時(shí)，使用不同濃度 (10-4，10-5，10-6，10-7和10-8mol·L-1) MHIF對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行處理，其中對(duì)照組補(bǔ)加與藥物組等體積藥物溶劑(DMSO)，藥物濃度參考前期文獻(xiàn)報(bào)道黃酮類化合物[4]，使用不同濃度MHIF對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行處理后，通過(guò)測(cè)定ALP活性找到最合適濃度的藥物濃度。

1.6成骨細(xì)胞的阻斷劑處理 待成骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)融合生長(zhǎng)達(dá)到80%～90%時(shí)，加入100 μmoL·L-1的L-NMA預(yù)處理成細(xì)胞，然后對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行隨機(jī)分組，使用10-6mol·L-1MHIF進(jìn)行處理檢測(cè)各項(xiàng)結(jié)果。

1.6.1堿性磷酸酶活性的測(cè)定 MHIF處理成骨細(xì)胞后，使用堿性磷酸酶試劑盒測(cè)定其活性。具體操作參見(jiàn)說(shuō)明書(shū)，按照1：1的比例分別加入基質(zhì)液1和基質(zhì)液2，然后37 ℃水浴15 min后加入顯色劑，避光混勻后在507 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度(A)值，然后依據(jù)說(shuō)明書(shū)換算成金氏單位。

1.6.2骨鈣素含量測(cè)定 MHIF處理成骨細(xì)胞后，測(cè)定培養(yǎng)液中骨鈣素含量。收集血清，室溫放置5 min 后，400×g離心10 min，檢測(cè)骨形成指標(biāo)骨鈣素含量。嚴(yán)格按照EIA kit試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定，測(cè)定結(jié)束后，嚴(yán)格按照測(cè)定A值和標(biāo)準(zhǔn)品濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6.3NO含量檢測(cè) MHIF處理后，每組取培養(yǎng)液 500 μL，測(cè)定培養(yǎng)液中硝酸鹽含量，以硝酸鹽含量來(lái)反映一氧化氮(NO)生成量。具體操作按照硝酸還原酶法一氧化氮試劑盒說(shuō)明書(shū)。將各樣品加至96孔板中，紫外分光光度計(jì)上測(cè)定波長(zhǎng)550 nm處A值，利用NO含量計(jì)算公式計(jì)算出樣本NO含量。

1.6.4cGMP含量檢測(cè) MHIF處理后，用4 ℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗培養(yǎng)細(xì)胞3次，每皿細(xì)胞加入0.25%胰蛋白酶1.5 mL收集細(xì)胞，4 ℃、200×g離心10 min，棄上清液，加PBS 200μL渦旋震蕩混勻，沸水浴10 min。冷卻后，5000×g離心10 min，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)法定量檢測(cè)環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cGMP)。紫外分光光度計(jì)測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處A值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的A值計(jì)算出濃度。

1.6.5蛋白電泳 MHIF處理成骨細(xì)胞后，開(kāi)始提取總蛋白，取出培養(yǎng)成骨細(xì)胞后PBS漂洗2次，每一個(gè)60 mm皿中加入蛋白裂解液300 μL，放免沉淀檢測(cè)法(radio immunoprecipitation assay，RIPA)，低溫靜置裂解30 min，收集裂解液，5000×g離心離心30 min，收集上清液，取出20 μL，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加上樣緩沖液，煮沸變性10 min，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｊ榛蛩徕c聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)檢測(cè)蛋白電泳，按照每孔總蛋白上樣量為20 μg，根據(jù)BCA定量蛋白濃度計(jì)算上樣體積，在電泳結(jié)束后，將SDS上蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，轉(zhuǎn)膜條件：電流280 mA轉(zhuǎn)膜60～80 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后5%脫脂奶粉封閉2 h，加入sGC和PKG一抗(1：1000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，結(jié)束后搖床振蕩洗膜3次，每次10 min，加入二抗37 ℃孵育1.5 h，洗膜3次，每次10 min，暗室加入電致化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence，ECL)發(fā)光液檢測(cè)蛋白的表達(dá)情況，用X射線片記錄結(jié)果，IPP6.0掃描蛋白條帶灰度。

2 結(jié)果

2.1MHIF對(duì)成骨細(xì)胞作用濃度篩選 結(jié)果見(jiàn)圖1。10-6mol·L-1MHIF為促進(jìn)成骨細(xì)胞最合適濃度。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，10-4～10-6mol·L-1MHIF處理成骨細(xì)胞，隨著藥物濃度降低，ALP活性逐漸升高，其中10-6mol·L-1組ALP活性最高為71.23 U·g-1，然而，MHIF在10-6～10-8mol·L-1，隨著濃度降低，ALP活性也逐漸降低。

2.2MHIF對(duì)成骨細(xì)胞骨鈣素表達(dá)的影響 結(jié)果見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，骨鈣素的表達(dá)與MHIF具有濃度依賴性，10-6mol·L-1MHIF組骨鈣素含量最高，為633 ng·mL-1。

2.3L-NMA對(duì)MHIF提高ALP活性的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MHIF組ALP活性顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，MHIF組ALP活性顯著高于L-NMA+MHIF組(P<0.05)，其他組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

2.4L-NMA對(duì)MHIF提高成骨細(xì)胞骨鈣素含量影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MHIF組骨鈣素含量高于對(duì)照組(P<0.01)，MHIF組骨鈣素含量顯著高于L-NMA+MHIF組(P<0.01)，其他組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖4。

與對(duì)照組比較，*1P<0.01；與MHIF組比較，*2P<0.05

Compared with control group,*1P<0.01; Compared with MHIF group,*2P<0.05

Fig.3EffectofL-NMAtreatmentonALPactivityenhancementbyMHIF

與對(duì)照組比較，*1P<0.01；與MHIF組比較，*2P<0.01

Compared with control group,*1P<0.01; Compared with MHIF group,*2P<0.01

2.5L-NMA對(duì)MHIF提高成骨細(xì)胞NO濃度的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MHIF組NO含量高于對(duì)照組(P<0.01)，MHIF組NO含量顯著高于L-NMA+MHIF組(P<0.05)，其他組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5。

2.6L-NMA對(duì)MHIF提高成骨細(xì)胞cGMP濃度的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MHIF組cGMP含量高于對(duì)照組(P<0.01)，MHIF組cGMP含量顯著高于L-NMA+MHIF組(P<0.05)，其他組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖6。

2.7對(duì)成骨細(xì)胞sGC和PKG蛋白表達(dá)影響 結(jié)果見(jiàn)圖7。L-NMA處理成骨細(xì)胞后，MHIF提高sGC和PKG蛋白的表達(dá)水平受到抑制。

與對(duì)照組比較，*1P<0.01；與MHIF組比較，*2P<0.05

Compared with control group,*1P<0.01; Compared with MHIF group,*2P<0.05

Fig.5EffectofL-NMAtreatmentonNOenhancementbyMHIF

與對(duì)照組比較，*1P<0.01；與MHIF組比較，與*2P<0.05

Compared with control group,*1P<0.01; Compared with MHIF group,*2P<0.05

Fig.6EffectofL-NMAtreatmentoncGMPenhance-mentbyMHIF

圖7 MHIF對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞內(nèi)sGC和PKG蛋白表達(dá)水平的影響

Fig.7EffectofMHIFontheproteinexpressionofsGCandPKGinosteoblastsculturedinvitro

3 討論

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物具有重要的藥理活性，尤其是對(duì)骨代謝調(diào)節(jié)作用，但具體機(jī)制尚未完全清楚。筆者在本研究首先研究不同濃度MHIF對(duì)體外培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細(xì)胞的骨形成活性的影響，1×10-6mol·L-1MHIF能顯著提高成骨細(xì)胞中ALP活性和骨鈣素含量，并且存在一定劑量依賴性。目前研究表明，通過(guò)提高血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮改善心腦血管疾病[5]，本實(shí)驗(yàn)研究MHIF促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞成骨性分化過(guò)程中是否激活NO信號(hào)通路。

成骨細(xì)胞在骨代謝過(guò)程中扮演著骨形成的角色，如果能有效促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨性分化，那么就能促進(jìn)骨形成。因此，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細(xì)胞在不同的藥物干預(yù)后其成骨性分化的相關(guān)指標(biāo)，堿性磷酸酶和骨鈣素是成骨細(xì)胞成骨性分化的標(biāo)志性指標(biāo)，因此首先從ALP活性和骨鈣素含量水平[6]，篩選最佳促進(jìn)成骨細(xì)胞成骨性分化的的最適濃度為10-6mol·L-1，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞分化過(guò)程具有劑量依賴性，黃酮類化合物調(diào)節(jié)骨骼代謝存在劑量的依賴性。

NO參與調(diào)控多種生理過(guò)程，包括骨重建[7-8]。NO可結(jié)合到可溶性鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶(soluble guanylate cy-clase，sGC)的血紅素基團(tuán)上，提高該酶活性[9]，由此引起cGMP水平升高，從而導(dǎo)致 cGMP 依賴性蛋白激酶級(jí)聯(lián)激活，以及進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路發(fā)揮生理活性作用。體外研究表明，由成骨細(xì)胞自身產(chǎn)生的少量 NO，可能是成骨細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)因子產(chǎn)生的調(diào)節(jié)劑[10-12]。NO 供體內(nèi) NO 的緩慢釋放誘導(dǎo)體外成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MHIF促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞成熟與礦化過(guò)程中激活NO信號(hào)途徑。使用L-NMA預(yù)處理成骨細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，MHIF促進(jìn)成骨細(xì)胞中ALP活性和骨鈣素含量的能力受到抑制，因此初步證明MHIF促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞分化過(guò)程中需要激活一氧化氮合酶參與其中。其次，本研究進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，一氧化氮合酶活性被抑制后，MHIF提高成骨細(xì)胞NO和cGMP含量均受到抑制，以成骨細(xì)胞中sGC和PKG蛋白的表達(dá)水平也受到抑制，因此進(jìn)一步證明MHIF在促進(jìn)成骨細(xì)胞骨形成過(guò)程中通過(guò)NO/cGMP/sGC信號(hào)過(guò)程發(fā)揮作用。

成骨細(xì)胞在骨形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用成骨細(xì)胞研究MHIF對(duì)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞的藥理活性，以及其促進(jìn)成骨性分化的分子機(jī)制，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MHIF在促進(jìn)體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞成骨性分化過(guò)程中激活NO信號(hào)通路，實(shí)驗(yàn)因此推測(cè)這個(gè)機(jī)制為MHIF調(diào)節(jié)骨代謝可能機(jī)制之一，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果為異黃酮類化合物的藥物促進(jìn)活性的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，下一步有待從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)水平證明其活性和作用機(jī)制。