王杏利，王爽，張雷，羅玉琴，韋銘旻，吳春勇，張峻穎

(1.中國藥科大學(xué)中藥制藥系，南京 211198；2.廣東食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證審評中心，廣州 510080；3.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，濟(jì)南 250101；4.中國藥科大學(xué)藥物分析系，南京 210009)

口服給藥簡單，方便，患者依從性高，是藥物遞送的最優(yōu)選途徑。但目前超過40%市售藥物、60%研發(fā)中藥物都存在難溶性問題。得益于載體輔料的開發(fā)應(yīng)用，改善疏水性藥物的溶解性和生物利用度已有多種方法，如：使用磷脂復(fù)合物、生物相容性聚合物、固體分散體、脂質(zhì)體或膠束等[1-4]。但目前滿足上述方法要求、符合中藥成分特性的輔料尤為缺乏。本課題組前期發(fā)現(xiàn)一些糖基化苷類化合物在水性環(huán)境中，能夠形成與表面活性劑相似的結(jié)構(gòu)，可作為固體分散體的載體，實(shí)現(xiàn)難溶性藥物的高效增溶[5-7]。羅漢果甜苷是羅漢果的甜味成分。植物含量較高且水溶性好，目前已經(jīng)有純度98%以上成品用作食品添加劑，其甜度為蔗糖的300倍。羅漢果苷V是羅漢果甜苷的主要成分，是一種天然小分子化合物，由親水性葡萄糖基和疏水性三萜類兩部分組成，與已報(bào)道的糖苷類增溶載體結(jié)構(gòu)相似，故選其為載體，以研究其對難溶性藥物的增溶效果。羅漢果苷V甜度高，熱穩(wěn)定性好，色澤淺，易于使用，不受pH值(pH值在2～10)的影響。它在中國、美國、日本等一些國家作為非營養(yǎng)性天然甜味劑而聞名[8]。同時，含葡基輔料還可能通過與葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(glucose transporter 1，GLUT1)結(jié)合實(shí)現(xiàn)跨越血-腦屏障，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)藥物的腦靶向轉(zhuǎn)運(yùn)[9]。

紫杉醇(paclitaxel，PTX)是一種從短葉紅豆杉(taxus brevifolia)莖皮中分離出來的復(fù)雜二萜類天然產(chǎn)物[10]，由于能夠與微管蛋白結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞死亡并影響微管動力學(xué)[11]，紫杉醇在治療乳腺癌、卵巢癌和非小細(xì)胞肺癌方面表現(xiàn)出優(yōu)異的抗腫瘤活性[12]。然而紫杉醇高度親脂，水中溶解度低，研究報(bào)道顯示其在小鼠中的生物利用度<3.6%[13]，這一缺陷大大限制紫杉醇的臨床應(yīng)用。已上市產(chǎn)品紫杉醇注射液(Taxol?，商品名：泰素)使用乙醇和聚氧乙烯蓖麻油(50：50)的共溶劑系統(tǒng)來增加其溶解度，由于聚氧乙烯蓖麻油存在顯著的毒副作用，如神經(jīng)毒性、腎毒性、變態(tài)反應(yīng)等[14]，給患者的生命健康帶來極大的危害。所以，新型載體或輔料的發(fā)掘，可為紫杉醇的臨床制劑進(jìn)一步開發(fā)提供幫助。

因此，筆者以羅漢果苷V為載體，以紫杉醇為模型藥，采用溶劑法制備紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體?？疾炱滹柡腿芙舛群腕w外溶出特征，通過差示熱掃描法(differential scanning calorimetry,DSC)考察紫杉醇在固體分散體中的物理存在形態(tài)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 LC-2010CHT液相色譜儀(含高壓泵、柱溫箱、自動進(jìn)樣器、紫外檢測器、LC solution色譜工作站，日本島津公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BT125D電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，感量：0.01 mg)；XW-80A旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置(含N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、OSB-2100型油浴鍋，上海愛朗儀器有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；DKZ系列電熱恒溫振蕩水槽(上海一恒科技有限公司)；2XZ-2型旋片式真空泵(臨海市永昊真空設(shè)備有限公司)；差示掃描量熱儀NETZSCH DSC 204(NETZSCH GERAETEBAU GmbH)等。

1.2試藥 紫杉醇對照品(阿拉丁，含量：99%，批號：E1822047)；羅漢果苷V(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，含量：98%，批號：PRF8093001)；去離子水；乙腈為色譜純；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1紫杉醇-羅漢果苷V物理混合物的制備 取紫杉醇適量，按1：5，1：10，1：15，1：20(W/W)添加相應(yīng)量的羅漢果苷V，置于研缽中研細(xì)，混勻，置干燥器中備用。

2.2紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體的制備 采用溶劑法制備紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體，按1：20(W/W)稱取適量紫杉醇和羅漢果苷V，加入適量的80%乙醇，常溫下50 Hz超聲30 min，置于50 ℃水浴鍋中進(jìn)行減壓濃縮干燥60 min，即可得到固體分散體。得到固體狀固體分散體，用研缽研磨均勻，置干燥器中備用。

2.3高效液相色譜(HPLC)測定紫杉醇

2.3.1色譜條件 色譜柱：Inertsil?ODS-3(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；柱溫：30 ℃；檢測波長：227 nm； 流速：1 mL·min-1；流動相：乙腈-水(65：35)。

2.3.2紫杉醇對照品溶液的配制 精密稱定紫杉醇10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加入乙腈5 mL，超聲使其溶解，用乙腈定容，配制得濃度約為1 mg·mL-1紫杉醇對照品溶液。

2.3.3羅漢果苷V對照品溶液的配制 精密稱定羅漢果苷V 10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加入乙腈5 mL，超聲使其溶解，用乙腈定容，配制得濃度約為1 mg·mL-1羅漢果苷V對照品溶液。

2.3.4紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體溶液的配制 精密稱定紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體10 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加入乙腈5 mL，超聲使其溶解，用乙腈定容，配制得濃度約為1 mg·mL-1紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體溶液。

2.3.5專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取空白溶劑、羅漢果苷V對照品溶液、紫杉醇對照品溶液和紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體溶液，按“2.3.1”條件，進(jìn)行HPLC分析，紫杉醇典型色譜圖見圖1。結(jié)果表明，在本色譜條件下，紫杉醇峰形良好，保留時間約為6.8 min，空白溶劑和羅漢果苷V對主峰的測定無干擾。

2.3.6檢測限及定量限 取“2.3.2”項(xiàng)制備的紫杉醇對照品溶液，按一定比例稀釋，得到一系列濃度溶液，進(jìn)行HPLC分析，紫杉醇檢測限(S/N=3)和定量限(S/N=10)分別為20 ng·mL-1和50 ng·mL-1(n=5)。

2.3.7線性關(guān)系考察 取“2.3.2”項(xiàng)制備的紫杉醇對照品溶液，按一定比例稀釋，得到濃度分別為0.05，0.1，0.2，1，5，10，25，50 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)液，按“2.3.1”項(xiàng)條件進(jìn)行HPLC分析，以紫杉醇峰面積(A)為縱坐標(biāo)，紫杉醇濃度(C，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明紫杉醇在0.05～50 μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：A=44 827C+387.46，R2=1.000 0。

A.空白溶劑；B.羅漢果苷V對照品溶液；C.紫杉醇對照品；D.紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體溶液；1.羅漢果苷V；2.紫杉醇

圖1 4種溶液的HPLC圖譜

1.blank solution；B.mogroside-V reference solution；C.paclitaxel reference solution；D.paclitaxel-mogroside-V SD solution；1.mogroside-V； 2.paclitaxel

Fig.1HPLCchromatogramsoffourkindsofsolution

2.3.8精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取“2.3.2”項(xiàng)制備紫杉醇對照品溶液0.5 mL，置于100 mL量瓶中，加流動相定容，得到5 μg·mL-1紫杉醇溶液。按“2.3.1”項(xiàng)方法重復(fù)測定6次，結(jié)果峰面積穩(wěn)定，RSD為0.8%，表明儀器精密度良好。

2.3.9重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體(1：20)約20 mg，共6份，精密稱定。置于10 mL量瓶中，加適量乙腈溶解并定容。精密量取0.5 mL，置10 mL量瓶，加流動相定容。配制得相當(dāng)于紫杉醇含量5 μg·mL-1溶液。按“2.3.1”項(xiàng)方法測定，計(jì)算6份樣品中的紫杉醇含量。測定6份固體分散體中紫杉醇的含量分別為4.3%，4.2%，4.3%，4.4%，4.4%，4.3%，RSD為1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.10穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取“2.3.9”項(xiàng)下含紫杉醇5 μg·mL-1的紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體溶液，室溫下放置0，2，4，6 h，按“2.3.1”項(xiàng)方法分別測定，紫杉醇峰面積RSD為0.06%，表明紫杉醇溶液在室溫下6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.11加樣回收率實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[15]方法，分別精密稱取紫杉醇適量，按處方比例(1：20)添加羅漢果苷V，分別制成高、中、低濃度溶液各3份，按“2.3.1”項(xiàng)方法測定。分析結(jié)果見表1，加樣回收率在97.9%～101.5%，方法準(zhǔn)確度良好。

2.4紫杉醇與羅漢果苷V投藥比例篩選 根據(jù)物理混合物飽和溶解度測定。取紫杉醇-羅漢果苷V不同比例的物理混合物(相當(dāng)于紫杉醇1 mg)，置于2 mL EP管中，加水0.5 mL，置于恒溫振蕩水浴鍋中，37 ℃振搖飽和24 h，后取上清液，用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按“2.3.1”項(xiàng)方法測定紫杉醇濃度。結(jié)果如圖2。結(jié)果顯示隨著羅漢果苷V加入量的增加，紫杉醇的增溶倍數(shù)增加，故最終選取紫杉醇-羅漢果苷V 1：20(W/W) 為處方制備固體分散體。

表1 紫杉醇加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1Resultsofrecoverytestofpaclitaxel

濃度水平加入量測得量mg回收率平均回收率RSD%高12.0412.12100.712.0212.20101.5101.20.4612.0112.19101.5中10.0110.07100.610.0210.04100.2100.40.2110.0110.06100.5低8.038.04100.18.027.8597.999.21.168.017.9899.6

圖2 紫杉醇/羅漢果苷Ⅴ物理混合物的增溶倍數(shù)變化曲線

Fig.2Solubilizationfoldcurveofpaclitaxel-Mog-Vphysicalmixture

2.5固體分散體飽和溶解度實(shí)驗(yàn) 分別取紫杉醇和紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體(相當(dāng)于紫杉醇1 mg)，置于2 mL EP管中，加水0.5 mL，置于恒溫振蕩水浴鍋中，37 ℃振搖飽和24 h，用孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液按“2.3.1”項(xiàng)方法測定紫杉醇濃度。結(jié)果顯示紫杉醇的飽和溶解度約為0.1 μg·mL-1，紫杉醇/羅漢果苷V固體分散體的飽和溶解度約為37.5 μg·mL-1。與紫杉醇比較，固體分散體的飽和溶解度增加約375倍，表明羅漢果苷V明顯增加紫杉醇的溶解度。

2.6DSC法分析 分別取紫杉醇、羅漢果苷V、紫杉醇與羅漢果苷V的物理混合物(1：20)、紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體適量，置于鋁制坩堝內(nèi)，蓋上蓋子，密封。測試條件為：以空鋁坩堝為參比，升溫速率：10 ℃·min-1，掃描范圍：40～300 ℃，結(jié)果見圖3。由DSC圖可知，紫杉醇和羅漢果苷V分別在214和178.8 ℃處各有一吸熱峰。紫杉醇和羅漢果苷V物理混合物的DSC圖為兩者圖譜的疊加，分別在177和210 ℃處有吸熱峰。而固體分散體的DSC圖中，紫杉醇的吸熱峰消失，僅在164.6 ℃處出現(xiàn)一個微小的吸熱峰，表明以羅漢果苷V為載體，紫杉醇在固體分散體的制備過程中，由晶體轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形或極其微小的晶體。

圖3 羅漢果苷V(A)、固體分散體(B)、物理混合物(C)、紫杉醇(D) DSC圖譜

Fig.3DSCthermogramsofmogroside-V(A)，SD(B)，PM(C)，andpurepaclitaxel(D)

2.7體外溶出度實(shí)驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[16]方法，以恒溫振蕩水浴鍋為溶出裝置，以pH值 6.8磷酸鹽溶液(含0.2%聚山梨酯80)為溶出介質(zhì)，每個溶出杯加入溶出介質(zhì)100 mL，振蕩頻率50 r·min-1，溫度為(37±0.5) ℃。稱取等價(jià)于主藥約2 mg的紫杉醇、物理混合物(1：20)、固體分散體分別加入溶出介質(zhì)中，于5，10，20，30，60，120 min定時定位取樣1 mL，經(jīng)孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液。同時向溶出杯中補(bǔ)加新鮮介質(zhì)1 mL。取出的樣品立即按“2.3.1”項(xiàng)方法測定紫杉醇濃度，重復(fù)3次。結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示紫杉醇在120 min時累積溶出度為12%，紫杉醇-羅漢果苷V(1：20)物理混合物累積溶出度在120 min達(dá)到36.3%。紫杉醇-羅漢果苷V固體分散體在5 min時溶出度就達(dá)到42.2%，120 min時累積溶出度達(dá)到83.9%。與紫杉醇比較，固體分散體和物理混合物的溶出速率和累積溶出度都有明顯的提高，說明羅漢果苷V能夠顯著增加難溶性藥物紫杉醇的體外溶出。

累積溶出量(%)=(溶出的總物質(zhì)量/投入量)×100%

溶出的總物質(zhì)量=當(dāng)前取樣點(diǎn)介質(zhì)濃度×介質(zhì)體積+(之前取樣點(diǎn)介質(zhì)濃度×取樣量)

圖4 紫杉醇、物理混合物和固體分散體的體外溶出曲線

Fig.4Dissolutioncurvesofpaclitaxel,PMandSD

3 討論

筆者在本研究以食品添加劑羅漢果苷Ⅴ為固體分散體的載體，考察不同投藥比例對紫杉醇增溶效果的影響。以藥物增溶倍數(shù)為指標(biāo)，篩選出最佳的固體分散體投藥比例為1：20(W/W)。同時，本研究建立了靈敏度高、準(zhǔn)確度好、檢測范圍廣的HPLC法，用于測定制劑中紫杉醇的含量。另外，通過DSC分析法驗(yàn)證紫杉醇在固體分散體中以無定形或微小晶體形式存在，顯示出該制劑中紫杉醇的增溶機(jī)制是改變其難溶性的晶體結(jié)構(gòu)及降低晶體的大小。飽和溶解度和體外溶出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以羅漢果苷V為載體，能有效提高難溶性藥物紫杉醇的溶解度，進(jìn)而改善其溶出速率和累積溶出度。

本研究的固體分散體處方簡單、制備工藝簡便，不僅顯著提高紫杉醇的飽和溶解度，還有效改善其體外溶出性能。羅漢果苷V作為食品添加劑，安全、無毒。該研究結(jié)果表明羅漢果苷V有望成為新型載體輔料，在難溶性藥物的制劑開發(fā)中具有極大應(yīng)用價(jià)值。