區(qū)景運(yùn)，譚曉軍，胡波，劉璠娜，尹良紅

(1 開平市中心醫(yī)院，廣東開平529300；2 暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院)

腎細(xì)胞癌簡稱腎癌，是泌尿生殖系統(tǒng)中的高發(fā)惡性腫瘤。其治療方案主要為手術(shù)切除，但術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移仍為臨床一大難題。由于腎癌細(xì)胞膜表面具有藥物泵蛋白，可加速腎癌細(xì)胞中藥物的泵出[1，2]；因此，相對(duì)于其他惡性腫瘤，腎癌對(duì)化療和放療敏感性弱，預(yù)后不良[3]。Notch信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲等重要生物學(xué)行為，該通路異?；罨蛇^度激活下游癌基因發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子1(HES1)、髓細(xì)胞組織增生蛋白(MYC)及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子2A(CDKN2A)、Cyclin D1及Bcl-2的表達(dá)，調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。Long等[4]研究發(fā)現(xiàn)，自我更新基因Bmi-1是一種良好的腎癌預(yù)后指標(biāo)，腎癌患者Bmi-1表達(dá)量顯著高于健康人，并且患者Bmi-1表達(dá)水平越高，總體生存率越低。PTC-209是一種新型Bmi-1小分子抑制劑，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)其可在體內(nèi)外抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖及生存[5～7]。至今，未見PTC-209對(duì)腎癌作用的報(bào)道。2018年3～8月，我們觀察了PTC-209對(duì)腎癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并進(jìn)一步探討其可能的機(jī)制，為開發(fā)腎癌治療新藥物及新靶點(diǎn)奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 腎癌細(xì)胞株786-O購于ATCC公司，PTC-209購于Selleckchem公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、PBS、胰酶均購于Gibco公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購于Dojindo公司；qRT-PCR引物由上海英濰捷基公司設(shè)計(jì)并提供，逆轉(zhuǎn)錄及SYBR試劑盒購于Takara公司；Annexin-V/PI雙染凋亡試劑盒購于凱基生物有限公司；PI周期試劑盒購于BD公司；細(xì)胞克隆結(jié)晶紫染色液購于廣州威佳公司；抗體購于CST公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱及生物安全柜購于Thermo公司；倒置顯微鏡購于Leica公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 786-O細(xì)胞以完全培養(yǎng)基(含10% FBS的DMEM)于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞增殖至培養(yǎng)瓶80%左右時(shí)，消化并傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞存活率測(cè)算 采用CCK-8法。取對(duì)數(shù)生長期狀態(tài)良好的786-O細(xì)胞以6×103/孔接種于96孔板中，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁過夜。將培養(yǎng)基更換為含PTC-209藥物的培養(yǎng)液，濃度分別為0、1、2.5、5、10 μmol/L，設(shè)立空白及對(duì)照孔，每濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。藥物作用24、48 h后加CCK-8 10 μL/孔，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，檢測(cè)450 nm處的吸光度值并計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)孔-空白孔)吸光度值/(對(duì)照孔-空白孔)吸光度值×100%。

1.2.3 細(xì)胞周期分布情況觀察 采用流式細(xì)胞儀。將786-O細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板中，貼壁24 h后將培養(yǎng)基更換為PTC-209藥物濃度為0、1、2.5、5、10 μmol/L的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；收集細(xì)胞并用PBS清洗3次，加入75%乙醇固定，4 ℃存放24 h。PBS洗滌3次后加入500 μL PI重懸細(xì)胞，4 ℃避光孵育0.5 h，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。

1.2.4 細(xì)胞凋亡情況觀察 采用流式細(xì)胞儀。將786-O細(xì)胞以1×106/孔接種于6孔板中，貼壁24 h后將培養(yǎng)基更換為PTC-209藥物濃度為0、1、2.5、5、10 μmol/L的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；收集細(xì)胞并用PBS清洗3次，加入100 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞；加入APC和PI各5 μL，常溫下避光孵育0.5 h，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡細(xì)胞并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 細(xì)胞克隆形成情況觀察 采用克隆形成實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長期的786-O細(xì)胞，以2×102/孔接種于6孔板中；細(xì)胞貼壁后，將培養(yǎng)基更換為PTC-209藥物濃度為0、1、5、10 μmol/L的新鮮培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周；用PBS沖洗干凈，4%多聚甲醛固定1 h后充分清洗，用結(jié)晶紫染色1 h；充分洗掉染色液，倒置顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)克隆形成個(gè)數(shù)。

1.2.6 細(xì)胞遷移能力觀察 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。用胰酶消化對(duì)數(shù)生長期的786-O細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度并以1×106/孔接種6孔板，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；待細(xì)胞融合度度達(dá)90%～100%時(shí)，用200 μL的無菌槍頭迅速在細(xì)胞中劃痕，同時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為PTC-209藥物濃度為0、1、5、10 μmol/L的培養(yǎng)基。分別于加藥0 h和48 h后于倒置顯微鏡下拍照，Image J軟件計(jì)算各個(gè)圖像的無細(xì)胞區(qū)域面積(S)。細(xì)胞遷移率=(S0 h-S48 h)/S0 h×100%。

1.2.7 細(xì)胞中Notch1、HES1、MYC、CDKN2A、Cyclin D1和Bcl-2蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。收集0、5 μmol/L PTC-209藥物處理24 h后的細(xì)胞，充分沖洗3遍后加入適量細(xì)胞裂解液，冰上充分裂解30 min，提取全細(xì)胞蛋白并用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白分子量配置合適濃度的SDS-PAGE膠，每個(gè)電泳通道加入25 μg蛋白，100 V恒壓電泳約1.5 h；250 mA恒流濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，將PVDF膜置于5%脫脂牛奶溶液中封閉2.5 h；分別將PVDF膜孵育相應(yīng)一抗溶液，4 ℃冰箱孵育過夜；用含有0.1% Tween-20的TBS-T洗滌一抗3次，10 min/次；室溫下孵育二抗2 h；TBS-T漂洗二抗4次，6 min/次；PVDF膜瀝干后加入超敏ECL發(fā)光液，于Tannon成像系統(tǒng)中顯影；用Image J軟件計(jì)算蛋白灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度比值表示其相對(duì)表達(dá)量。

1.2.8 細(xì)胞中Notch1、HES1、MYC、CDKN2A、Cyclin D1和Bcl-2基因檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。收集0、5 μmol/L PTC-209藥物處理24 h后的細(xì)胞，TRIzol裂解并提取細(xì)胞總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。引物序列：Notch1上游5′-GGTTCCGAAGAAGATGCTCCAG-3′，下游5′-GCGTTGCACAGCTCAATGTG-3′；HES1上游5′-AGGCGGCTAAGGTGTTTGG-3′，下游5′-CGTTGGGAATGAGGAAAGCAA-3′；MYC上游5′-CACATGCCCAAGATTCACTGATAG-3′，下游5′-GAGGTGGCTTGGACAGGTTAG-3′；CDKN2A上游5′-GCCCTAAGCGCACATTCATG -3′，下游5′-GCTAGCAGTGTGACTCAAGAGAAG-3′；Cyclin D1：上游5′-CTGGGTCTGTGCATTTCTGGTT-3′，下游5′-CTGCTGGAAACATGCCGGTTA-3′；Bcl-2上游5′-GAGCACAGAAGATGGGAACACT -3′，下游5′-AGGTGCATGGATTTACTCAGTATC-3′；GAPDH上游5′-CCTGCACCACCAACTGCTTAG-3′，下游5′-TGAGTCCTTCCACGATAC-CAA -3′。20 μL qRT-PCR擴(kuò)增體系包含SYBRGreen混合物10 μL，DEPC水6.4 μL，cDNA 2 μL和上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，按照TaKaRa說明書推薦程序進(jìn)行上機(jī)反應(yīng)。內(nèi)參基因選用GAPDH，利用2-ΔΔCt法分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PTC-209對(duì)786-O細(xì)胞存活的影響 結(jié)果見表1。

表1 PTC-209對(duì)786-O細(xì)胞存活的影響

注：與同時(shí)點(diǎn)0 μmol/L PTC-209比較，*P<0.05；與同濃度PTC-209作用24 h比較，#P<0.05。

2.2 PTC-209對(duì)786-O細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響 結(jié)果見表2。

表2 不同濃度PTC-209藥物對(duì)786-O細(xì)胞凋亡及周期的影響

注：與0 μmol/L PTC-209比較，*P<0.05。

2.3 PTC-209對(duì)786-O細(xì)胞遷移能力的影響 1、5、10 μmol/L PTC-209作用后細(xì)胞遷移率分別為52%±11%、36%±7%、25%±3%，均低于0 μmol/L時(shí)的65%±4%(P均<0.05)。

2.4 PTC-209對(duì)786-O細(xì)胞克隆形成能力的影響 1、5、10 μmol/L PTC-209作用后細(xì)胞克隆形成數(shù)分別為(50.67±6.34)、(26.33±4.99)、(6.67±2.05)個(gè)，均少于0 μmol/L時(shí)的(77.33±8.73)個(gè)(P均<0.05)。

2.5 細(xì)胞中Notch1、HES1、MYC、CDKN2A、Cyclin D1和Bcl-2表達(dá)比較 結(jié)果見表3。

表3 細(xì)胞中Notch1、HES1、MYC、CDKN2A、Cyclin D1和Bcl-2表達(dá)比較

注：與0 μmol/L PTC-209比較，*P<0.05。

3 討論

腎癌是第七常見惡性腫瘤，病死率高。腎癌占成人惡性疾病的2%～3%，全球發(fā)病率逐年上升，每年新增患者20.9萬例，死亡10.2萬例。此外，腎癌患者5年生存率與疾病分期密切相關(guān)，TNM Ⅰ～Ⅳ期患者5年生存率從81%可降至8%；約30%的初診患者出現(xiàn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其5年生存率下降約10%。病情復(fù)發(fā)是目前腎癌治療所面臨的一大難題，高達(dá)40%的患者在首次手術(shù)后5年內(nèi)出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)[8]。

Bmi-1是一種位于10號(hào)染色體的癌基因，即B細(xì)胞特異的莫洛尼鼠白血病病毒插入位點(diǎn)1基因，屬于多梳基因家族(PcG)成員之一。PcG家族是由多種與細(xì)胞周期和增殖相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子組成，是一類重要的與發(fā)育相關(guān)的基因，在干細(xì)胞的維持、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生中有著不可忽視的作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1基因在腎癌等多種癌組織中的表達(dá)高低與腫瘤形成、疾病進(jìn)展、侵襲與轉(zhuǎn)移、疾病不良預(yù)后密切相關(guān)[10]。文獻(xiàn)報(bào)道，Bmi-1與Notch在腫瘤組織中高表達(dá)并具有相關(guān)性，對(duì)乳腺癌患者病情的發(fā)生、發(fā)展具有促進(jìn)作用[11]。Notch信號(hào)通路可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化及凋亡，對(duì)機(jī)體正常發(fā)育至關(guān)重要，是許多重要信號(hào)通路的主要組成部分和關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)。Notch受體激活后經(jīng)過ADAM金屬蛋白酶和γ分泌酶介導(dǎo)的一系列酶促分裂反應(yīng)，促使Notch1移位至細(xì)胞核，進(jìn)而與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，激活下游靶基因HES1、CDKN2A、MYC、Cyclin D1、Bcl-2的轉(zhuǎn)錄活性;HES1、CDKN2A和MYC影響細(xì)胞的增殖及遷移，Cyclin D1及Bcl-2分別調(diào)控著細(xì)胞周期和凋亡,從而影響細(xì)胞增殖能力[12～15]。Kreso等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Bmi-1小分子抑制劑PTC-209可抑制Bmi-1活性，通過PRC1下調(diào)CDKN2A轉(zhuǎn)錄活性，抑制下游靶基因p16INK4A和p14ARF激活，阻滯腫瘤細(xì)胞周期進(jìn)展并促進(jìn)凋亡蛋白Bcl-2的翻譯，殺傷血液腫瘤細(xì)胞。Ohtaka等[17]報(bào)道，PTC-209通過抑制白血病細(xì)胞中Bmi-1蛋白活性從而促使Notch1失活，減少Notch1移位至細(xì)胞核中發(fā)揮促進(jìn)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，HES及MYC蛋白翻譯作用減弱，Cyclin D1蛋白表達(dá)量下降，Caspase-3活性增加，導(dǎo)致白血病細(xì)胞發(fā)生凋亡及細(xì)胞周期阻滯。

本研究結(jié)果顯示，隨著PTC-209作用濃度升高及作用時(shí)間的延長，786-O細(xì)胞存活率減少；隨著PTC-209作用濃度升高，786-O細(xì)胞凋亡率、G0/G1期細(xì)胞比例增加，S期及G2/M期細(xì)胞比例、細(xì)胞遷移率及克隆形成數(shù)減少；與0 μmol/L比較，5 μmol/L的PTC-209作用后細(xì)胞中Notch1、HES1、MYC、CDKN2A、Cyclin D1、Bcl-2基因及蛋白表達(dá)均減少。這提示Bmi-1小分子抑制劑PTC-209可抑制腎癌786-O細(xì)胞增殖、遷移及克隆形成能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期進(jìn)展，該作用與其抑制Bmi-1蛋白活性并影響Notch1蛋白作用于下游靶分子HES、Cyclin D1、MYC、CDKN2A及Bcl-2有關(guān)。因此，Bmi-1可作為腎癌治療的靶點(diǎn)，而PTC-209有望成為腎癌治療的有效藥物。