劉星玥，張珍禎，陳春林，馬浩

(宜春學(xué)院，江西宜春336000)

糖尿病神經(jīng)病理性疼痛(DNP)是指由糖尿病誘發(fā)的外周及中樞神經(jīng)病變所致的頑固性疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。目前DNP治療藥物主要有醛糖還原酶抑制劑、血管擴(kuò)張劑、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)劑、自由基清除劑等，臨床應(yīng)用結(jié)果顯示以上藥物對(duì)患者肢端麻木的改善效果較好，但對(duì)減輕疼痛效果不明顯。作為二線(xiàn)治療的阿片類(lèi)藥物或非甾體類(lèi)抗炎藥，雖然具有良好的鎮(zhèn)痛活性，但多伴有較嚴(yán)重的不良反應(yīng)并易導(dǎo)致嚴(yán)重的軀體或心理依賴(lài)。因此，DNP的治療已成為世界疼痛領(lǐng)域面臨的一大難題，尋找新的安全有效的治療藥物迫在眉睫。胍丁胺(AGM)是精氨酸在左旋精氨酸脫羧酶(L-ADC)催化下脫羧基而成的一種內(nèi)源性生物活性物質(zhì)，對(duì)炎性疼痛或慢性神經(jīng)源性疼痛都有一定的鎮(zhèn)痛效應(yīng)。然而，有關(guān)AGM治療DNP的效果及作用機(jī)制的報(bào)道鮮見(jiàn)。2018年3～8月，我們采用鏈脲佐菌素(STZ)構(gòu)建DNP大鼠模型，以經(jīng)典神經(jīng)病理性疼痛治療藥加巴噴丁(GP)為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)觀察其行為學(xué)和脊髓組織中磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(p-ERK)表達(dá)變化，探索AGM的鎮(zhèn)痛機(jī)制，旨在為DNP的臨床治療提供安全有效的新型治療藥物奠定理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料 SPF級(jí)SD雄性大鼠，體質(zhì)量180～200 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(湘)2016-0002，所有操作符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。STZ(批號(hào)S0130)、AGM(批號(hào)A7127)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，加巴噴丁(批號(hào)G122413)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；ERK1/2及p-ERK1/2兔抗大鼠多克隆抗體購(gòu)自南京巴傲得生物科技有限公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德公司，蛋白提取試劑盒、ECL增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒和BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；Imark酶標(biāo)儀、Trans-Blot1703920蛋白電泳儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，Alpha Imager HP凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Alpha公司，YLS-22A型足底觸痛儀購(gòu)自北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNP模型構(gòu)建 大鼠在自然光線(xiàn)，自由攝食、飲水條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。進(jìn)行基礎(chǔ)閾值檢測(cè)，剔除先天對(duì)痛覺(jué)不敏感的大鼠。大鼠夜間禁食不禁水12 h后，單次腹腔注射新鮮配制STZ溶液65 mg/kg；于注射后 72 h，測(cè)量尾靜脈空腹血糖，隨機(jī)血糖濃度≥16.7 mmol/L且穩(wěn)定認(rèn)為制備糖尿病大鼠模型成功。于注射14 d后，測(cè)定糖尿病大鼠機(jī)械縮足閾值(MWT)、熱縮足潛伏期(TWL)，降低幅度﹥20%基礎(chǔ)閾值視為DNP模型制備成功。

1.2.2 動(dòng)物分組及藥物干預(yù) 取32只DNP模型大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組各8只。注射STZ后第15天起，AGM-150、AGM-300組分別腹腔注射AGM 150、300 mg/kg，GP組腹腔注射GP 100 mg/kg，模型組腹腔注射等量生理鹽水；另取8只正常小鼠作為對(duì)照組，腹腔注射等量生理鹽水。各組均腹腔注射1次/d，連續(xù)14 d。

1.2.3 大鼠血糖測(cè)定 分別于STZ注射前1 d(0 d)，STZ注射后7、14、21、28 d，取尾靜脈血，用三諾安穩(wěn)型血糖儀測(cè)定空腹血糖。

1.2.4 大鼠疼痛行為學(xué)檢查 分別于STZ注射前1 d(0 d)，STZ注射后7、14、21、28 d，測(cè)量MWT和TWL等疼痛行為學(xué)指標(biāo)，測(cè)定時(shí)間均于每日9:00～16:00完成。維持室溫25 ℃左右，將大鼠置于足底觸痛儀實(shí)驗(yàn)箱中適應(yīng)30 min后即可開(kāi)始進(jìn)行測(cè)量。按照激光定位大鼠后肢足底掌心，視頻屏幕協(xié)助定位；用足底觸痛儀記錄底部針頭或熱觸頭從上升至接觸大鼠足底到引起大鼠足部挪開(kāi)刺激位置的力(即為MWT)或時(shí)間(即為T(mén)WL)，讀數(shù)精確至0.1 N或0.1 s；重復(fù)3次，取平均值作為統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù),每次測(cè)量間隔時(shí)間不少于3 min。為避免損傷動(dòng)物，選取的最大測(cè)試壓力為55 N、觸發(fā)溫度為35 ℃。

1.2.5 大鼠脊髓組織p-ERK蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。行為學(xué)檢查后，冰上迅速斷頭處死大鼠，快速剪取脊髓L4～L6節(jié)段；加入細(xì)胞裂解液后置于勻漿器中充分勻漿，冰上裂解30 min后轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管；4 ℃下以12 000 r/min離心15 min，取上清液。BCA法測(cè)定樣本蛋白濃度后，按1∶4加入5×上樣緩沖液，煮沸變性5 min后-20 ℃保存。將樣本蛋白在10% SDS-PGE凝膠系統(tǒng)中上樣電泳，采用濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓120 V電泳。電泳完成后裁取所需分子量的凝膠，濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h；加入兔源p-ERK一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，洗滌液漂洗濾膜3 次，每次 10 min；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫?fù)u床孵育1 h，Washing Buffer 漂洗3次，每次10 min。凝膠成像儀曝光成像，用Image J圖像分析軟件對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行測(cè)定。曝光結(jié)束后，膜再生液洗脫p-ERK抗體；將PVDF膜與兔源ERK(1∶1 000)一抗孵育，再按前述方法操作后曝光成像。以p-ERK與總ERK蛋白條帶灰度值的比值來(lái)表示p-ERK的表達(dá)變化水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血糖水平比較 見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠MWT、TWL比較 見(jiàn)表2、表3。

表1 各組大鼠血糖水平比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

表2 各組大鼠MWT比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，cP<0.01。

表3 各組大鼠TWL比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01。

2.3 各組大鼠脊髓p-ERK表達(dá)比較 與對(duì)照組大鼠脊髓p-ERK表達(dá)量(2 460.55±110.41)比較，模型組p-ERK蛋白表達(dá)量(4 431.22±434.78)增加(P<0.05)；與模型組比較，AGM-150組(2 422.35±145.42)、AGM-300組(3 375.4±304.38)、GP組(2 761.19±337.71)大鼠脊髓p-ERK表達(dá)量均降低(P<0.05或<0.01)。

3 討論

DNP的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前尚缺乏確切的病因?qū)W解釋。約87%的糖尿病患者長(zhǎng)期承受著神經(jīng)病變所致的慢性疼痛，治療上主要依賴(lài)于改善患者血糖水平及促進(jìn)外周神經(jīng)損傷的修復(fù)[1]。由于疼痛是一種不愉快的主觀情感體驗(yàn)，只能將疼痛閾值作為疼痛的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。研究表明，腹腔注射STZ可引起機(jī)械痛覺(jué)過(guò)敏和觸覺(jué)異常性疼痛[2]。本研究采用單次腹腔注射STZ 65 mg/kg制備糖尿病大鼠模型，利用MWT、TWL作為疼痛指標(biāo)，造模后大鼠MWT、TWL均明顯下降，且降低幅度﹥20%基礎(chǔ)閾值，證明DNP大鼠模型制備成功。

AGM是咪唑啉受體的內(nèi)源性配體，作為一種新的神經(jīng)遞質(zhì)/調(diào)質(zhì)，參與多種疾病的病理過(guò)程，具有神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)、鎮(zhèn)痛，促細(xì)胞增殖，預(yù)防和治療阿片所致軀體、精神依賴(lài)和復(fù)吸等重要藥理作用，有良好的開(kāi)發(fā)前景及應(yīng)用價(jià)值。內(nèi)源性AGM可能通過(guò)激活功能性咪唑啉受體Nischarin蛋白參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)阿片功能的調(diào)節(jié)來(lái)產(chǎn)生鎮(zhèn)痛效應(yīng)[3]。在大鼠醋酸扭體實(shí)驗(yàn)中，外源性給予AGM可以觀察到明顯的鎮(zhèn)痛活性[4]。蘭忠平等[5]采用蜜蜂毒新型炎性痛模型,鞘內(nèi)同時(shí)注射AGM與嗎啡可發(fā)揮協(xié)同鎮(zhèn)痛作用。坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠海馬內(nèi)注射AGM(1～10 μg)，可劑量依賴(lài)性地減輕其神經(jīng)病理性疼痛，可能與海馬σ受體調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子α(TNF-α)表達(dá)減少有關(guān)[6]。本研究結(jié)果表明，AGM(150、300 mg/kg)能顯著提高DNP大鼠的MWT、延長(zhǎng)TWL，且AGM 300 mg/kg作用效果與GP相當(dāng)，證明AGM能減輕糖尿病大鼠神經(jīng)病理性疼痛。本研究中AGM對(duì)DNP大鼠TWL的延長(zhǎng)效果沒(méi)有MWT增高的明顯，可能與儀器探頭接觸大鼠足部肉墊有關(guān)。除了對(duì)大鼠行為學(xué)上的影響，本研究發(fā)現(xiàn)AGM(150、300 mg/kg)均可降低DNP大鼠血糖水平，與Molderings等[7]的研究結(jié)論一致。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞水平上，AGM對(duì)STZ誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷具有抑制作用，可能與其激活咪唑啉受體I3亞型有關(guān)。這提示AGM可能通過(guò)激活咪唑啉受體，降低血糖水平來(lái)延緩DNP進(jìn)程，改善DNP癥狀。

ERK家族有5個(gè)亞族，其中ERK1/2通過(guò)級(jí)聯(lián)信號(hào)將細(xì)胞外刺激傳遞至細(xì)胞核、磷酸化轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，參與細(xì)胞增殖、分化、存活、死亡等神經(jīng)細(xì)胞重要功能的調(diào)控，在疼痛及痛覺(jué)過(guò)敏信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起重要作用。ERK1/2的磷酸化含量可反映多種刺激誘發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞的快速變化,是一種新型神經(jīng)細(xì)胞活動(dòng)的功能指標(biāo)[9]。在多種病理性疼痛模型中，均發(fā)現(xiàn)ERK信號(hào)通路參與了脊髓水平傷害性信號(hào)調(diào)節(jié)和中樞敏感化的形成[10,11]。傷害性刺激使脊髓背角或背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞ERK發(fā)生磷酸化，磷酸化的ERK一方面通過(guò)磷酸化神經(jīng)細(xì)胞膜離子通道或受體，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的興奮性；另一方面激活核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)傷害性刺激引起的靶基因表達(dá)，介導(dǎo)疼痛及痛覺(jué)敏化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Han等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性損傷(CCI)模型中，脊髓背角p-ERK水平顯著上調(diào)；早期鞘內(nèi)注射促分裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)抑制劑U0126，可有效阻斷和延遲CCI誘導(dǎo)的機(jī)械性異常性疼痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏。秦曉輝等[13]研究結(jié)果表明，AGM對(duì)甲醛所致大鼠疼痛反應(yīng)有明顯的鎮(zhèn)痛作用；并且，在甲醛致痛前預(yù)先給予AGM 160 mg/kg，能明顯抑制甲醛所致脊髓背角磷酸化ERK表達(dá)量的上調(diào)。以上研究提示，ERK信號(hào)通路可能在DNP中同樣起到了至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AGM(150、300 mg/kg)可降低DNP大鼠脊髓ERK磷酸化水平。這提示AGM對(duì)DNP大鼠的鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與抑制脊髓p-ERK的激活，減少脊髓內(nèi)傷害性信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)。

AGM為中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所承擔(dān)的重大新藥創(chuàng)制課題在研項(xiàng)目，目前尚未在國(guó)內(nèi)上市，故而國(guó)內(nèi)未有相關(guān)臨床應(yīng)用報(bào)道。在國(guó)外，已有研究表明高劑量硫酸胍丁胺方案(2.670 g/d)可連續(xù)安全食用長(zhǎng)達(dá)5年，且在整個(gè)研究期間未出現(xiàn)不良反應(yīng)[14]。研究表明，在膳食中添加AGM可用于緩解腰椎間盤(pán)相關(guān)神經(jīng)根病的疼痛，改善生活質(zhì)量[15]。

綜上所述，本研究基于大鼠DNP模型，揭示了AGM具有明顯地調(diào)節(jié)血糖及鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能與其對(duì)血糖的調(diào)節(jié)及抑制脊髓ERK蛋白的活化有關(guān)，為其臨床應(yīng)用奠定了一定的理論基礎(chǔ)。