楊亞旭 李躍華 魏小二

腫瘤微血管密度已經作為評估腫瘤微血管生成的重要標志之一，是代表性的量化指標，其與血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達正相關。MVD增加，腫瘤浸潤和轉移的惡性潛能也顯著增加，是腫瘤侵襲性的特征性生物學指標之一[1]。然而，目前評價MVD的方法是創(chuàng)傷性的、要求取材非常準確，并且無法對腫瘤血管生成活性進行功能評價，因此這些缺點使之不能成為一

種理想的檢查手段。體素內不相干運動（intravoxel incoherent motion，IVIM）最早由Le等[2]學者提出，是一種多b值、無創(chuàng)性以及可重復性反映活體組織水分子運動的成像方法，對腫瘤解剖結構的顯示、腫瘤血管生成的評估以及抗腫瘤血管的療效和預后有著重大價值。國外學者已經應用IVIM技術針對中樞神經系統(tǒng)[3]、乳腺病變[4]、肝硬化[5]、腎臟[6]及胰腺病變[7]進行成像，然而在軟組織腫瘤方面的研究還鮮有報道。

方 法

1.基本材料

將40只新西蘭大白兔隨機分為4組，分別為1周組（10只）、2周組（10只）、3周組（10只）、4周組（10只），以正常大腿肌肉組織作為對照組。將荷瘤兔腫瘤取出剪碎后制成VX2腫瘤懸液，將腫瘤懸液注入兔大腿肌肉內制作成實驗兔后進行磁共振掃描。

2.MR掃描設備參數(shù)

上述4組實驗兔在VX2瘤細胞植入后1周均進行磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）掃描，明確4組腫瘤種植是否成功以及了解4組間VX2腫瘤的初始狀況，同時1周組MRI掃描結束后處死荷瘤兔、取出腫瘤組織進行分析。完成第一次MRI掃描后，2周組在種植后2周、3周組在種植后3周、4周組在種植后4周進行MRI掃描，各組在MRI掃描后處死實驗兔，取出腫瘤組織進行分析。

采用 3.0T 臨床用MRI掃描儀（Ingenia， 荷蘭飛利浦公司）和8通道頭顱表面線圈（上海辰光醫(yī)療科技股份有限公司）進行掃描。具體掃描序列和 掃 描 參 數(shù) 如 下：T2W： TR/TE=2800/100ms，NSA=4， 層 厚 =2mm， FOV=180×180mm，矩 陣=224×224。T1W 和 增 強 后 T1W（post-T1W）：TR/TE=500/20ms， NSA=4， 層 厚 =2mm，F(xiàn)OV=180×180 mm，矩陣=224×224。DWI（彌散加權成像）采用ss-EPI序列（單次激發(fā)平面回波序列）來完成：TR/TE=2000/86ms， NSA=4，層厚=2mm，F(xiàn)OV=180×180mm，矩陣=75×75，b值分別為0，800s/mm2，ADC圖由掃描機器自帶軟件自動生成。IVIM序列參數(shù)與DWI一致，但是b值不同，b值分別采用0、25、50、75、100、150、200、400、600、800s/mm2。增強掃描如下：經兔耳緣靜脈按0.1mmol/kg注射Gd-DTPA（馬根維顯，469.01mg/ml，拜爾先寧）后，進行增強后T1W掃描，掃描參數(shù)如前所述。

3.數(shù)據(jù)處理

將IVIM數(shù)據(jù)傳輸至后處理工作站，利用MRI/DWI Toolbox后處理軟件包生成D、D*、f偽彩圖。以T2W、T1W、post-T1W圖像為參考，在T2W橫斷面圖像中選取腫瘤組織最大層面圖像，避開囊變壞死，在腫瘤實性部分取3點作為ROI（region of intrest）區(qū)進行測量，分別測量D、D*、f值，三點平均值作為測量最終結果，ROI面積3.2～4.0cm2，平均3.5cm2。以post-T1W圖像為基礎來計算各組VX2腫瘤體積。同時在VX2腫瘤同側大腿肌肉劃定感興趣區(qū)，測量上述MRI定量參數(shù)作為參照。

4.組織學分析

實驗兔在完成MRI掃描后處死實驗兔，將位于兩側后肢根部背側的VX2腫瘤完整剝離切除，經10%甲醛溶液固定，切取相應組織塊進行石蠟包埋，選取與MRI像最大層面相對應的石蠟塊進行切片，分別進行蘇木精-伊紅（HE）染色和CD34免疫組化分析。最后再對CD34的結果進行半定量分析，來計算微血管數(shù)。

5.統(tǒng)計學分析

使用 SPSS 16.0進行統(tǒng)計學分析（Chicago，IL，USA)，P＜0.05被認為有統(tǒng)計學意義。所有數(shù)值均輸入到excel表格并以均數(shù)±標準差來表示。使用單因素方差分析分析各組間病灶體積、MVD數(shù)以及各MRI參數(shù)之間的差異，利用Pearson相關檢驗分析MRI參數(shù)與MVD指數(shù)之間的相關關系。

結 果

1.一般情況

4組實驗兔均完成了最終的MRI掃描，所有實驗兔均造模成功，共發(fā)現(xiàn)80個VX2腫瘤。4組實驗兔的肌肉組織的ADC值、D值、D*值和f值之間均無明顯統(tǒng)計學差異（P均＞0.05），表明本研究所采用的MRI-IVIM掃描以及后處理方法也是穩(wěn)定、可靠的。此外，各組在腫瘤種植后1周時腫瘤體積、ADC值、D值、D*值和f值之間也均無統(tǒng)計學差異（P均 ＞0.05）。

2.腫瘤體積、MVD以及ADC值、D值、D*值和f值參數(shù)的動態(tài)變化

隨著時間的推移，腫瘤體積急劇增加，在2周時出現(xiàn)壞死。2周組體積大于1周組（P=0.054），3周組大于2周組（P＜0.001）、4周組大于3周組（P＜0.001）。關于VX2腫瘤的ADC值，2周組的小于1周組（P＜0.001），3周組小于2周組（P＜0.001），4周組也小于3周組（P=0.013）。腫瘤的MVD在腫瘤的不同階段也存在差異，2周組的MVD大于1周組（P＜0.001），3周組的 MVD大于 2周組（P＜0.001），而4周組的MVD也小于3周組的MVD（P＜0.001）。2周組的f值大于1周組（P＜0.001），3周組的f值大于2周組（P＜0.001），而4周組的f值小于3周組（P＜0.001）。2周組的D值小于1周組（P＜0.001），3周組的D值小于2周組（P=0.004），而3周組和4周組D值之間的值無明顯統(tǒng)計學差異（P=0.212）。2周組的D*值大于1周組（P＜0.001），3周組的D*值小于2周組（P＜0.001），而4周組的D*值相對于3周組有降低的趨勢（P=0.067）（表1，圖1、2）。

表1 各組VX2腫瘤ADC值、MVD計數(shù)、D值、D*值和f值之間的比較

表2 VX2腫瘤的ADC值、D值、D*值和f值與MVD計數(shù)之間的相關性

圖1 每組代表性實驗兔的MRI圖像。不同時間點的VX2腫瘤，其ADC值、f值、D值和D*值也發(fā)生動態(tài)變化。

圖2 每組代表性實驗兔的CD34免疫組化圖。CD34染色顯示CD34陽性內皮細胞染成褐色，與相鄰腫瘤細胞有明顯分離，不同時間點的VX2腫瘤CD34陽性存在差異。

3.MRI-IVIM定量參數(shù)與MVD計數(shù)之間的相關性

4周組D*值與MVD計數(shù)之間存在統(tǒng)計學相關性趨勢，其他各組D*值和f值與MVD計數(shù)之間均存在統(tǒng)計學相關性，而各組ADC值和D值與MVD計數(shù)之間均無明顯統(tǒng)計學相關性（表2）。

討 論

本研究采用彌散序列成像來反映腫瘤組織內的灌注信息，盡管彌散與灌注之間存在一定的聯(lián)系，但兩者之間仍然存在一定的差異。目前臨床內應用的彌散序列所包含的不僅僅是水分子運動的信息，也包含了毛細血管灌注信息，即在小b值彌散成像時所得到的ADC值主要由毛細血管內的血液灌注所貢獻。本研究在應用多b值成像時利用低b值的圖像部分從而獲得腫瘤內的灌注信息。從病理學角度來看，毛細血管內灌注與腫瘤內MVD密切相關，其血管密度直接決定了單位時間內從毛細血管內流入腫瘤細胞內的血流量。從本研究結果來看，隨著VX2腫瘤的進展，MVD的變化與D*及f值呈一定的相關性，而與ADC及D值無明顯相關性。對此我們的解釋是MVD主要反映了腫瘤微血管的定量指標，即在單位組織內毛細血管的量化。D*值主要是反映毛細血管內流出到組織間隙的灌注值，f值反映的是微循環(huán)灌注所占整個血流灌注的比值。本研究中在腫瘤生長早期的大多數(shù)腫瘤細胞處于G1期及S期，VX2的種植時間延長，腫瘤的進展，在S期及G2期其表達急劇增加，腫瘤細胞增殖活躍，其侵襲性更強、惡性程度更高，其特征表現(xiàn)為腫瘤微血管的密度增加。隨著腫瘤進展，腫瘤細胞密度相對增加，其對應的影像學指標ADC值相對也降低，同時D值是反映水分子彌散的指標，隨著腫瘤進展，D值下降，這與以往研究結果較為一致。Chandarana等[8]在以IVIM研究腎臟時發(fā)現(xiàn)，D*及f值針對腎臟腫瘤的定性與分型具有重要的意義。在與病理對照研究發(fā)現(xiàn)，f值及D*值可以反映腫瘤血管的密集程度與VEGF的表達。而本研究中的其他參數(shù)如ADC值在b值＞200mm2/s所反映主要是水分子彌散與血流灌注的綜合值；D值則反映的是水分子彌散的實際情況，二者與腫瘤血管的量化相關性不如f值及D*值。本研究只研究到腫瘤種植后的28天，其主要原因為在28天左右的大體病理標本中已經出現(xiàn)腫瘤的壞死。在腫瘤出現(xiàn)壞死后，影響其血流灌注的因素將多樣化，隨著腫瘤細胞進展，腫瘤的供血不足時，腫瘤細胞的灌注不僅僅由MVD所決定，其他因素如組織內靜水壓在腫瘤進展末期由次要因素變?yōu)橹饕蛩亍?/p>

腫瘤血管生成是實體性腫瘤生長和轉移的基礎，間質流體壓力（IFP）是反映腫瘤血管的一項指標，在正常組織中，新生血管受促血管生成因子和抗血管生成因子的共同作用調控，處于一種平衡狀態(tài)。然而腫瘤組織中，這種平衡被打破，導致雜亂的不正常新生血管生成， 這些不正常的結構導致了腫瘤血管上的滲漏及血管中血液的異常，進而導致淋巴系統(tǒng)的異常，因此增加了組織液壓。腫瘤部位的異常脈管系統(tǒng)與較高的IFP阻礙了藥物的傳輸，并且有研究指出IFP在腫瘤缺氧、周圍血管生成、腫瘤周圍淋巴管生成和淋巴結轉移的發(fā)展中起著重要作用。因此，IFP已被認為是治療實體腫瘤的關鍵障礙之一。比較困難的是目前沒有可靠的生物標志物來檢測IFP。先前研究表明，IFP的升高會導致腫瘤血流減少，我們假設可以用擴散加權圖像（DWI）作為一種手段來檢測毛細血管血流減少。Kim等[9]采用擴散加權圖像（DWI）對乳腺癌模型小鼠進行研究，并在此基礎上進行了針刺IFP測定。用傳統(tǒng)的單指數(shù)模型和雙指數(shù)模型進行Voxel分析后得出結論：擴散系數(shù)D與IFP相關，IFP與f和D*的中位數(shù)乘積相關，支持使用IVIMDWI指標作為腫瘤IFP的無創(chuàng)生物標志物，利用這一無創(chuàng)性的成像方法在抗腫瘤血管生成治療中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，非侵入性、快速、可重復地顯示腫瘤血管特征的特性，對于評估腫瘤血管生成，抗血管生成藥物療效和預后具有重要的臨床意義。本研究以兔的肌肉組織VX2模型為研究對象，采用IVIM 成像技術研究不同時期腫瘤內MVD變化，發(fā)現(xiàn)IVIM成像可以用來評價腫瘤血管的特性并具有一定的價值。