張祥 楊洛 徐雄峰

[摘要]目的 研究肉蓯蓉提取物松果菊苷（Echinacoside，ECH）對糖尿病心肌病db/db小鼠模型心肌細胞是否具有保護作用及可能的作用機制。方法 將29只SPF級6周齡雄性db/db小鼠和db/m小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按照隨機數(shù)字表法取9只db/m小鼠作為正常對照組（db/m組，n=9），將db/db小鼠分為糖尿病心肌病組（db/db組，n=10）與松果菊苷干預組（db/db+ECH組，n=10）。其中db/db組和db/m組每日按照0.05 ml/10 g標準進行生理鹽水灌胃2周。db/db+ECH組小鼠按松果菊苷300 mg/（kg·d）灌胃2周。每周監(jiān)測三組的小鼠體重，觀察小鼠攝食、飲水及活動情況。于第10周用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠并處死，取尾靜脈血測定空腹血糖（FBG）。采用HE染色觀察心肌組織病理改變，采用Tunel染色法測定心肌細胞凋亡率，采用免疫印跡（Western blot）法檢測凋亡相關蛋白p53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8的表達水平，采用real-time PCR測定心肌細胞p53、p38MAPK mRNA和caspase mRNA、Bcl-2、Bax mRNA的表達水平。結(jié)果 與db/m組相比，db/db組小鼠的體重、血糖和血脂水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）。HE染色切片顯示，與db/m組比較，db/db組小鼠的心肌細胞可見明顯肥大、壞死，心肌細胞排列結(jié)構(gòu)紊亂；而db/db+ECH組小鼠的心肌細胞形態(tài)有所緩解，細胞間隙減少，排列較規(guī)則。Tunel染色觀察心肌細胞凋亡指數(shù)顯示，相較于db/m組，db/db組小鼠的心肌細胞凋亡程度顯著增高（P<0.01），同時伴有p53蛋白、p38MAPK蛋白、caspase-3和caspase-8蛋白表達量顯著升高（P<0.01），且p53、p38MAPK mRNA和caspase mRNA、Bax mRNA表達量明顯上升，Bcl-2 mRNA水平下調(diào)即Bcl-2/Bax水平降低（P<0.01）。與db/db組比較，db/db+ECH組上述指標均有明顯降低，且Tunel染色觀察小鼠心肌細胞凋亡指數(shù)顯著下降（P<0.01）。結(jié)論 松果菊苷能夠明顯改善db/db小鼠心肌細胞凋亡，其機制可能與通過p53/p38MAPK/caspase信號轉(zhuǎn)導途徑有關。

[關鍵詞]松果菊苷；糖尿病心肌??；凋亡；p53；p38MAPK

[中圖分類號] R542.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2019）5（a）-0013-06

[Abstract] Objective To study the protective effect of Echinacoside （ECH） from Cistanche deserticola extract on myocardial cells of diabetic cardiomyopathy db/db mice and its possible mechanism. Methods A total of 29 SPF grade 6-week-old male db/db mice and db/m mice were fed adaptively for one week， and 9 cses of db/m mice were selected as the normal control group （the db/m group， n=9） according to random number table method. The db/db mice were divided into the diabetic cardiomyopathy group （the db/db group， n=10） and the Echinacoside intervention group （the db/db+ECH group， n=10）. The db/db group and the db/m group were given saline for 2 weeks daily according to 0.05 ml/10 g standard. The mice in the db/db+ECH group were intragastrically administered with Echinacoside 300 mg/（kg·d） for 2 weeks. The weight of mice in three groups was monitored weekly， and the feeding， drinking and activity of mice were observed. At the 10th week， mice were anesthetized by intraperitoneal injection of 2% Pentobarbital Sodium and executed. The fasting blood glucose （FBG） was measured by tail vein blood. HE staining was used to observe the pathological changes of myocardial tissue， Tunel staining was used to determine the apoptotic rate of myocardial cells， Western blot was used to detect the expression levels of apoptotic-related proteins p53， p38MAPK， caspase-3 and caspase-8， and real-time PCR was used to detect the expression levels of p53， p38MAPK mRNA and caspase mRNA， Bcl-2 and Bax mRNA in myocardial cells. Results Compared with the db/m group， the body weight， blood glucose and blood lipid levels of mice in the db/db group increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. HE staining section showed that compared with db/m group， cardiac myocytes in the db/db group were obviously hypertrophic and necrotic， and the arrangement of cardiac myocytes was disordered. In the db/db+ECH group， the morphology of myocardial cells was alleviated， the intercellular space was reduced and the arrangement was regular. Tunel staining showed that the apoptotic index of cardiomyocytes in the db/db group was significantly higher than that in the db/m group （P<0.01）. At the same time， the expression of p53 protein， p38MAPK protein， caspase-3 and caspase-8 protein increased significantly （P<0.01）. The expression of p53， p38MAPK mRNA， caspase mRNA and Bax mRNA increased significantly， while the level of Bcl-2 decreased， that was the level of Bcl-2/Bax decreased （P<0.01）. Compared with the db/db group， the above indexes in the db/db+ECH group significantly decreased， and the apoptotic index of cardiomyocyte in mice was significantly decreased by Tunel staining （P<0.01）. Conclusion ECH can significantly improve the apoptosis of myocardial cells in db/db mice， and its mechanism may be related to the p53/p38MAPK/caspase signal transduction pathway.

[Key words] Echinacoside； Diabetic cardiomyopathy； Apoptosis； p53； p38MAPK

糖尿病心肌病是由糖尿病引起的廣泛心肌血管病變和心肌代謝紊亂而導致的心肌壞死性疾病[1]。疾病早期舒張功能不全通常表現(xiàn)為心肌順應性降低和舒張壓降低；晚期收縮功能障礙是最常見的，且極易發(fā)生充血性心力衰竭[1]。由于糖尿病心肌病的發(fā)病機制復雜，其通常在晚期才被發(fā)現(xiàn)，所以目前沒有特別有效的治療方法[2]。

松果菊苷（Echinacoside，ECH）是一種從管花肉蓯蓉莖中分離出來的天然化合物，其主要化學成分是苯乙醇苷[3]。其體內(nèi)外研究已被證明具有抗氧化、抗疲勞、抗炎、提高記憶力與神經(jīng)保護、抗腫瘤、保護肝臟及免疫調(diào)節(jié)等作用[4]。動物實驗顯示，預處理2 h的ECH組小鼠神經(jīng)細胞及肝細胞凋亡率較對照組明顯降低，caspase-3和caspase-8活性明顯減弱[5]。其中caspase-3為關鍵的執(zhí)行分子，其在凋亡信號傳導的許多途徑中發(fā)揮功能[6]。為進一步揭示ECH保護糖尿病心肌病心肌細胞凋亡的分子機制，本實驗以db/db小鼠作為糖尿病心肌病模型，研究心肌細胞凋亡調(diào)控關鍵蛋白p53及其下游信號通路中重要蛋白激酶p38MAPK是否參與ECH保護心肌細胞凋亡的調(diào)控。

1材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗采用從南京大學-南京生物醫(yī)藥研究院購買的成年雄性C57BLKS/J db/db小鼠和db/m小鼠（SPF級），其編號為SCXK（蘇）2015-0001，購回后分籠飼養(yǎng)于武漢大學人民醫(yī)院動物中心標準飼養(yǎng)房，室溫20℃，相對濕度50%～60%，24 h晝夜光照循環(huán)，適應性飼養(yǎng)1周。

1.2儀器與試劑

電子天平（METTER TOLEDO公司）；全自動顯微鏡BX63（日本Olympus公司）；基因擴增儀（美國ABI公司）；實時熒光定量PCR檢測儀（7500序列檢測系統(tǒng)）（美國ABI公司）；DYY7C型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（北京六一儀器廠）；成像系統(tǒng)（Q-IMAGING公司）。

ECH（上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號：150623）、Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號：15596-026）；PT-PCR以轉(zhuǎn)錄試劑盒；熒光定量PCR試劑盒；Tunel試劑盒（美國Roche公司，批號：11684817910）；二甲苯（國藥集團化學試劑有限公司，批號：10023418）；抗熒光淬滅封片劑（武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司，批號：AS1089）；DAPI染液（武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司，批號：AS1075）；

1.3方法

1.3.1分組及給藥 同窩出生6周齡小鼠經(jīng)檢疫及適應飼養(yǎng)1周后，隨機編號將db/db小鼠分為糖尿病心肌病組（db/db組，n=10）和ECH治療組（即藥物干預組）（db/db+ECH組，n=10）。選取9只db/m小鼠作為正常對照組（db/m組，n=9）。于8周齡時分別做如下干預：db/db組小鼠和db/m組小鼠每日按照0.05 ml/10 g生理鹽水灌胃10周，同時db/db+ECH組小鼠按松果菊苷300 mg/（kg·d）灌胃10周。每周監(jiān)測三組小鼠體重，觀察小鼠攝食、飲水及活動情況。于第10周用2%戊巴比妥鈉（上海禾豐制藥，批號：120201）腹腔注射麻醉小鼠（0.1 ml/10 g），毛細血管針眼眶后采血，迅速分離血清，置于-80℃冰箱保存待測。心臟灌流后，分離心臟組織，稱取心臟濕重，取一部分組織用4%多聚甲醛（谷歌生物科技有限公司，批號：WB1101）固定，用于做切片觀察心肌組織形態(tài)，剩余心臟組織置于液氮1 h后保存在-80℃冰箱，用于Real-time PCR和蛋白印跡檢測。

1.3.2觀察指標 觀察并記錄實驗期間各組小鼠的攝食、飲水、體重、行為和皮毛等一般情況。用全自動生化檢測儀檢測血清中血糖、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、三酰甘油（TG）。

1.3.3心臟組織切片Tunel染色心肌細胞凋亡水平 心肌細胞凋亡水平用Tunel試劑盒進行檢測。細胞凋亡晚期過程中，細胞核DNA斷裂，暴露的3′-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下加上熒光素（FITC）標記的dUTP（fluorescein-dUTP），從而可以通過熒光顯微鏡進行檢測細胞凋亡水平。心臟組織多聚甲醛預處理后，進行包埋、切片；然后依次將切片進行以下處理：放入二甲苯Ⅰ（20 min）-二甲苯Ⅱ（20 min）-無水乙醇Ⅰ（10 min）-無水乙醇Ⅱ（10 min）-95%乙醇（5 min）-90%乙醇（5 min）-80%乙醇（5 min）-70%乙醇（5 min）-蒸餾水洗滌；切片甩干后用組化筆畫圈防止液體流走，圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37℃孵育15 min后，將玻片置于PBS（pH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5 min；取Tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1（TdT）和試劑2（dUTP）按1∶9混合后加入圈內(nèi)覆蓋組織，37℃水浴鍋孵育60 min，加少量水保持濕度；PBS漂洗3次，每次5 min，加適量DAPI染液，室溫避光孵育5 min；PBS漂洗爬片3次，每次5 min，從6孔板內(nèi)取出爬片，將有細胞的一面封到滴加有抗熒光淬滅封片劑的載玻片上，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 HE染色觀察心肌組織病理改變 心臟組織切片，各組大鼠取5 μm大小心臟組織，用HE染色制片，放置在光學顯微鏡下觀察心肌組織病理改變及心肌細胞凋亡程度。

1.3.5 Western blot法測定小鼠心臟組織中p53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8蛋白表達水平 取各組小鼠心臟組織50 mg，用組織剪剪成細小碎片，加蛋白裂解液混勻，然后加入適量終濃度為1 mmol/L的PMSF抑制組織蛋白降解，冰浴裂解20 min；1200 r/min離心10 min，吸取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。將蛋白樣品及SDS-PAGE上樣緩沖液（2×）按1∶1配平后，沸水浴變性10 min，取50 μg蛋白樣品進行SD-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶搖床封閉1 h，分別加入一抗稀釋液（1∶800），4℃搖床過夜。細膜后，分別加入兔抗兔二抗稀釋液（1∶5000），室溫孵育1 h，洗膜后進行掃膜顯色，并分析各組條帶蛋白灰度值。每個指標對應組別連續(xù)檢測兩次，組別依次為db/m組、db/db組和db/db+ECH組。

1.3.6 Real-time PCR檢測小鼠心臟組織中p53、p38MAPK mRNA和caspase-3 mRNA、Bcl-2/Bax mRNA的表達水平 取各組小鼠心臟組織100 mg，用Trizol法提取總RNA，用基因擴增儀逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，每個樣本加入3個復孔。95℃預變性30 s，接著進行如下40個循環(huán)的擴增：PCR反應95℃ 5 s、60℃ 40 s；溶解95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s。選取管家基因GAPDH作為內(nèi)參照，使用ABI7500軟件2-ΔΔCT法處理數(shù)據(jù)，引物序列見表1。

1.4統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；相關指標之間采用直線相關分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠的一般情況及ECH對小鼠體重、心臟濕重、血糖的影響

研究結(jié)果顯示，db/m組小鼠飲水、攝食正常，毛色光滑；而db/db組和db/db+ECH組小鼠飲水、攝食量增加，毛色粗糙，活動度降低，尿量增加。與db/m組相比，db/db組小鼠體重和血糖明顯升高（P<0.01），db/db組小鼠心臟濕重明顯下降（P<0.01）；而與db/db組相比，db/db+ECH組小鼠體重和血糖明顯下降（P<0.05），心臟濕重明顯升高（P<0.01）（表2）。

2.2 ECH對各組小鼠血脂水平及心臟功能的影響

與db/m組小鼠相比，db/db組小鼠的ALT、AST及TG水平明顯升高（P<0.01）；與db/db組比較，db/db+ECH組小鼠上述指標能得到顯著緩解（P<0.01）（表3）。

2.3 ECH對各組小鼠心臟形態(tài)學的影響

HE染色顯示，db/m組小鼠心臟形態(tài)正常，心肌細胞清晰緊密排列，結(jié)構(gòu)清楚，少見細胞外基質(zhì)和纖維組織；db/db組小鼠心肌細胞可見明顯肥大、壞死，心肌細胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，可見少許胞外基質(zhì)沉積；與db/db組相比，db/db+ECH組小鼠心肌細胞形態(tài)有所緩解，細胞間隙減少，排列較規(guī)則，胞外基質(zhì)沉積改善（圖1，封四）。

2.4 ECH對各組小鼠心肌細胞凋亡率的影響

db/m組心肌細胞的總凋亡率為（1.86±0.49）%，db/db組小鼠的心肌細胞凋亡率顯著增加（P<0.01），為（31.66±2.89）%；而與db/db組相比，db/db+ECH組小鼠凋亡率顯著降低（P<0.01），為（8.35±1.13）%，提示ECH對小鼠心肌細胞凋亡具有明顯的改善作用（圖1、表4）。

2.5 ECH對小鼠心臟組織p53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8蛋白表達的影響

與db/m組相比，db/db組小鼠的心肌細胞p53、p38MAPK、caspase-3和caspase-8蛋白表達水平明顯升高（P<0.01）；與db/db組相比，db/db+ECH組蛋白表達水平顯著降低（P<0.01）（圖2、表5）。

2.6 ECH對小鼠心臟組織中p53、p38MAPK、caspase-3、Bcl-2/Bax mRNA表達水平的影響

實驗結(jié)果顯示，與db/m組比較，db/db組小鼠的心肌細胞p53、p38MAPK、caspase-3 mRNA水平明顯升高，Bcl-2/Bax水平降低（P<0.01）；經(jīng)ECH干預后，db/db+ECH組相關mRNA水平較db/db組顯著改善（P<0.01）（表6、圖3）。

3討論

糖尿病作為一種常見的慢性代謝紊亂癥，已被描述成為“冠心病的等價物”，并且被更多的認為是一種心血管疾病而非碳水化合物的代謝紊亂[7]。糖尿病患者微血管疾病和大血管疾病危險因素增高，且患有心臟病的非糖尿病患者心臟死亡率與此相當[8-9]。不斷有實驗研究和臨床證據(jù)顯示，糖尿病心肌病心肌功能不全與心肌細胞凋亡引起的心肌損傷密切相關[10]。本研究中，實驗動物db/db小鼠是由于瘦素受體基因異常剪接從而產(chǎn)生突變而具有明顯的高血糖、高血脂、高胰島素血癥等2型糖尿病特征，并且可以維持較為穩(wěn)定的高血糖狀態(tài)，是糖尿病心肌病的常用造模對象[11]。

本實驗通過對db/db小鼠進行ECH灌胃治療，觀察ECH對糖尿病小鼠心臟損傷的影響。結(jié)果顯示，經(jīng)ECH治療后，db/db組小鼠體重、心臟濕重均明顯下降，同時觀測到血清葡萄糖水平亦有所降低（P<0.05），提示ECH對db/db糖尿病小鼠糖尿病癥狀有改善作用。能量代謝紊亂作為糖尿病心肌病的重要發(fā)病機制之一，參與了糖尿病心肌病的發(fā)生與發(fā)展[12]。ALT、AST和TG雖常用來檢測肝臟代謝，但研究發(fā)現(xiàn)，其在心肌細胞損傷過程中，上述物質(zhì)釋放入血，血清水平會有所增高，并且血清TG水平增高的病理改變能夠加重糖尿病心肌病心肌脂質(zhì)沉積，進一步加速糖尿病心肌病的惡化[13]。通過檢測血清中ALT、AST和TG水平發(fā)現(xiàn)，較db/m組相比，db/db組上述指標均明顯升高，而ECH能夠抑制血清ALT、AST和TG水平的升高趨勢。

研究顯示，高糖培養(yǎng)24 h的H9c2心肌細胞、p38MAPK表達增加，凋亡細胞增加，活性氧增加，線粒體膜電位下降[14]。高糖、AGEs、氧化應激等因素可通過p38MAPK通路引起細胞凋亡，機制可能與p53、Bax、Bcl-2、氧化應激等有關[15]。本研究中，db/db小鼠心臟組織中的p53、p38MAPK、caspase-3蛋白表達水平較db/m組明顯升高；在db/db+ECH組小鼠心臟組織中，p53、p38MAPK、caspase-3水平較db/db組顯著升高，Bcl-2/Bax mRNA水平顯著降低，提示在糖尿病小鼠中p53/p38MAPK通路的激活，促進p38MAPK蛋白磷酸化從而激活下游相關凋亡蛋白caspase家族，上調(diào)caspase-3和caspase-8表達水平，啟動細胞凋亡級聯(lián)反應，抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達，上調(diào)促凋亡基因Bax的表達，最終導致心肌細胞凋亡；而經(jīng)ECH灌胃處理后，db/db小鼠能夠明顯抑制p53/p38MAPK通路的激活，影響db/db小鼠的心肌細胞凋亡進程，并通過調(diào)節(jié)細胞凋亡通路關鍵蛋白的表達來保護心臟功能，這一點與HE染色及Tunel染色觀察到的心臟組織形態(tài)學改變一致。

綜上所述，在db/db小鼠心臟組織中，心肌細胞凋亡是其發(fā)生、發(fā)展糖尿病心肌病的重要病理機制，ECH能夠保護db/db小鼠的心臟功能，其機制可能與抑制p53/p38MAPK/caspase信號通路，調(diào)節(jié)相關蛋白的表達從而改善心肌凋亡有關。

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（收稿日期：2018-09-25 本文編輯：祁海文）