雷 蕾，張 濤，葉 斌，吳春芝

1.成都市第六人民醫(yī)院腫瘤科，四川 成都 610051； 2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬成都三六三醫(yī)院消化內(nèi)科

胃癌是常見的危害人類健康的消化系統(tǒng)腫瘤之一，近年來發(fā)病率呈上升趨勢[1]。大量研究表明，腫瘤發(fā)生、發(fā)展與基因表達(dá)失調(diào)、缺失、突變等多種因素有關(guān)[2]，因此，尋找有效的腫瘤診療分子靶點受到廣泛關(guān)注。作為眾多生物學(xué)過程的分子物質(zhì)平臺，脂質(zhì)筏可將多種信號分子通路轉(zhuǎn)化為發(fā)揮各種功能的復(fù)合物，進(jìn)而影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展。脂筏結(jié)構(gòu)蛋白為脂質(zhì)筏的標(biāo)志物，包含脂筏結(jié)構(gòu)蛋白1(Flotillin-1，F(xiàn)LOT1)和脂筏結(jié)構(gòu)蛋白2(Flotillin-2，F(xiàn)LOT2)兩種同源亞型，F(xiàn)LOT2定位于染色體17q11-12，在人體不同組織細(xì)胞呈低表達(dá)，在多種腫瘤組織中FLOT2有高表達(dá)，影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展。如肺癌組織和細(xì)胞中FLOT2均高表達(dá)，其蛋白表達(dá)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，F(xiàn)LOT2高表達(dá)患者生存期低于低表達(dá)患者[3]。干擾FLOT2在腎癌、乳腺癌細(xì)胞表達(dá)可明顯抑制細(xì)胞增殖[4-5]。胃癌中FLOT2研究較少，有研究顯示，胃癌組織FLOT2蛋白呈高表達(dá)，其表達(dá)與侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，沉默其表達(dá)后可減弱癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力[6]。FLOT2對胃癌細(xì)胞凋亡的影響及機制研究尚未明確。因此，本研究首先檢測了不同胃癌細(xì)胞FLOT2表達(dá)，將設(shè)計合成的FLOT2 siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞，旨在探討FLOT2表達(dá)抑制對胃癌細(xì)胞凋亡變化，并進(jìn)一步研究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料人胃癌BGC823、SGC7901和MKN28細(xì)胞及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1均購自美國ATCC。DMEM培養(yǎng)基(批號：NAD1367)購自美國Gibco；FBS(批號：2104)購自杭州四季青；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自澳大利亞Bender Medsystems；FLOT2、NF-κB p65、IKKβ、pIKKβ和Bax抗體(批號：34365、83425、26845、149385、27745)均購自美國CST；流式細(xì)胞儀購自美國BD。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：GES1、BGC823、SGC7901和MKN28細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。實驗為生長至對數(shù)期的細(xì)胞。

1.2.2 siRNA設(shè)計合成：根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫提供的FLOT2基因序列及siRNA的設(shè)計原則，并參照有關(guān)文獻(xiàn)[7]的siRNA片段，設(shè)計FLOT2 siRNA(si-FLOT2組)及陰性對照siRNA(陰性組)序列，序列如下(僅列出正義鏈)：FLOT2 siRNA：5′-GCCUGUCCCUUCUGGUAAAdTdT-3′；陰性對照siRNA：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。經(jīng)序列比對，與其他基因均無同源性，由上海吉瑪合成。

1.2.3 siRNA轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染前1 d，接種BGC823細(xì)胞于無抗生素的DMEM完全培養(yǎng)基中，細(xì)胞70%～80%生長融合時，胰酶消化細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×105ml-1，每孔2 ml接種于6孔板。參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明制備siRNA-LipofectamineTM2000復(fù)合物，并將復(fù)合物加入至6孔板，加等體積無菌水為空白組，每組設(shè)置5個復(fù)孔，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換為含血清的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗研究。

1.2.4 Western blotting：RIPA細(xì)胞裂解液適量提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，按照4∶1比例將蛋白樣品與5×Loading buffer混合，煮沸變性3～5 min，取變性蛋白，每孔道40 μg，通過10%的SDS-PAGE，取分離后的蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂奶粉封閉膜1 h，加入FLOT2、NF-κB p65、IKK-β、pIKK-β和Bax一抗，工作液濃度均為1∶1 000，4 ℃孵育過夜，洗膜，加1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，洗膜，ECL試劑顯色，Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)及配套的軟件采集圖像。以GAPDH為內(nèi)參蛋白，以目的蛋白與內(nèi)參灰度值比值為蛋白相對表達(dá)量。實驗重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測：胰酶消化生長至對數(shù)期的BGC823細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1，常規(guī)培養(yǎng)24 h，將siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，取1 ml細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌及1×Binding buffer重懸后，分別加入Annexin V-FITC和PI，各為5 μl和10 μl，室溫避光15～20 min，加1×Binding buffer 300 μl，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 FLOT2在胃癌細(xì)胞表達(dá)Western blotting檢測人胃癌BGC823、SGC7901和MKN28細(xì)胞中FLOT2蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖1、表1所示，胃癌細(xì)胞中FLOT2蛋白表達(dá)均顯著高于人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES1(P<0.05)。

圖1 胃癌細(xì)胞FLOT2蛋白表達(dá)電泳圖Fig 1 Electrophoretic diagram of FLOT2 protein expression in gastric cancer cells

組別FLOT2蛋白相對表達(dá)量GES10.062±0.007BGC8230.561±0.049?SGC79010.323±0.030?MKN280.270±0.026?F值125.315P值0.000

注：與GES1細(xì)胞相比，*P<0.05。

2.2 si-FLOT2轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞效果si-FLOT2轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞48 h， Western blotting檢測FLOT2蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖2、表2所示，si-FLOT2組FLOT2表達(dá)顯著低于空白組(P<0.05)，而FLOT2在陰性組表達(dá)與空白組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 Western blotting檢測si-FLOT2轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞后FLOT2蛋白表達(dá)

Fig 2 The expression of FLOT2 protein after si-FLOT2transfected into BGC823 cells detected by Western blotting

2.3 si-FLOT2轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)BGC823細(xì)胞凋亡各組細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果如圖3、表3所示，si-FLOT2組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白組(P<0.05)。

注：與空白組相比，*P<0.05。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測si-FLOT2轉(zhuǎn)染的BGC823細(xì)胞凋亡率Fig 3 Apoptosis rate after si-FLOT2 transfected into BGC823 cells detected by flow cytometry

注：與空白組相比，*P<0.05。

2.4 si-FLOT2轉(zhuǎn)染抑制BGC823細(xì)胞NF-κB信號Western blotting檢測NF-κB信號通路NF-κB p65、IKK-β、p-IKK-β及下游促凋亡蛋白Bax的蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4、表4所示，與空白組比較，si-FLOT2組NF-κB p65、IKK-β和p-IKK-β蛋白表達(dá)顯著降低，Bax蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

圖4 Western blotting檢測si-FLOT2轉(zhuǎn)染后BGC823細(xì)胞NF-κB信號相關(guān)蛋白表達(dá)

Fig 4 Expression of NF-κB signal related protein in BGC823cells after si-FLOT2 transfected detected by Western blotting

表4 NF-κB p65、IKK-β、p-IKK-β和Bax蛋白相對表達(dá)量Tab 4 Relative expressions of NF-κB p65, IKK-β, p-IKK-β and Bax proteins

注：與空白組相比，*P<0.05。

3 討論

RNA干擾(RNAi)是指在真核生物內(nèi)，在dsRNA的誘導(dǎo)作用下，siRNA特異性結(jié)合于靶基因mRNA同源性序列，引起mRNA降低，從而沉默靶基因表達(dá)，它是基因轉(zhuǎn)錄后對基因表達(dá)調(diào)節(jié)的機制之一，具有普遍性、高效性和特異性的優(yōu)勢，近年廣泛地應(yīng)用于基因功能研究、腫瘤治療等方面[8-9]。因此，利用該技術(shù)抑制抑癌基因表達(dá)，可成為潛在的腫瘤治療手段。FLOT在眾多生物學(xué)過程中扮演重要角色，如細(xì)胞的增殖、凋亡、黏附等。FLOT2屬于FLOT家族成員之一，參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[10-11]。有研究顯示，siRNA介導(dǎo)的FLOT2蛋白表達(dá)水平的降低可明顯抑制Src酪氨酸激酶的活性，從而減緩TGF-β誘導(dǎo)的人鼻咽癌細(xì)胞株EMT過程[12]；FLOT2 siRNA可降低食管鱗狀細(xì)胞癌的生長和侵襲[13]。胃癌中FLOT2研究較少，有研究顯示，siRNA介導(dǎo)的FLOT2表達(dá)下調(diào)可抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移[6]。本研究旨在探討FLOT2 siRNA對胃癌細(xì)胞凋亡的影響及機制。首先檢測了不同胃癌細(xì)胞FLOT2蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)BGC823細(xì)胞中FLOT2表達(dá)最高，因此選擇作為后續(xù)研究對象。將FLOT2 siRNA按照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000說明轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中FLOT2表達(dá)明顯降低，且可明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

NF-κB是一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，屬于NF-κB/Rel蛋白家族，可介導(dǎo)免疫應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，近年研究顯示，NF-κB在多種腫瘤中呈高表達(dá)，其表達(dá)參與細(xì)胞增殖、侵襲行為、凋亡抑制和血管形成等[14-15]。也有研究指出，抑制NF-κB信號可降低腫瘤生長。如NF-κB抑制劑PDTC可抑制人骨髓瘤U266細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]；丹參酮ⅡA可抑制人胃癌 SGC7901細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，其機制可能是降低NF-κB信號通路NF-κB p65、磷酸化IκB-α、IKK-β和磷酸化IKK-β表達(dá)[17]。此外，NF-κB信號激活后抗胃癌凋亡的分子機制是直接調(diào)控下游靶基因表達(dá)，如可通過調(diào)控Bcl-2家族蛋白及caspase家族蛋白發(fā)揮抗凋亡作用。Bax是Bcl-2家族中的一員，是近年發(fā)現(xiàn)的哺乳動物促細(xì)胞凋亡基因，其過度表達(dá)可抑制Bcl-2功能，加速細(xì)胞凋亡，有些學(xué)者認(rèn)為Bcl-2/Bax比例是決定細(xì)胞是否凋亡的關(guān)鍵[18]。在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤中Bax低表達(dá)[19-20]。本研究檢測了FLOT2 siRNA轉(zhuǎn)染后的BGC823細(xì)胞NF-κB p65、IKK-β、p-IKK-β和Bax的蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NF-κB p65、IKK-β和p-IKK-β表達(dá)明顯降低，Bax表達(dá)升高。這提示FLOT2 siRNA對胃癌細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)機制可能與NF-κB信號下調(diào)有關(guān)。

綜上所述，RNAi抑制胃癌細(xì)胞FLOT2表達(dá)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，機制可能與NF-κB信號下調(diào)有關(guān)。該研究可能為FLOT2在胃癌中研究提供了一定的理論幫助，提示FLOT2可能是一個有效的診療靶點。值得進(jìn)一步深入探究。