時(shí)軍利， 王 磊， 王春青， 李 萍， 何培元， 李炳慶

承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，河北 承德 067000

食管癌是世界范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤，其死亡率較高，是癌癥死亡的第六大原因。食管癌在確診時(shí)通常處于晚期，患者預(yù)后不良，5年生存率低于10%[1]。越來越多的研究表明，食管癌患者的生存率較低，與局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2-3]。因此，深入探討食管癌的發(fā)病機(jī)制有助于食管癌早期診斷和臨床治療相關(guān)分子靶點(diǎn)的開發(fā)。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性、小的非編碼RNA分子，其通過與靶基因3′UTR互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合調(diào)節(jié)靶基因mRNA降解或抑制基因表達(dá)。最近研究數(shù)據(jù)表明[4-5]，異常的miRNA表達(dá)通常參與癌癥的發(fā)展，從包括食管癌在內(nèi)的各種癌癥的發(fā)病到轉(zhuǎn)移。目前研究顯示[6]，miR-9-5p在食管癌組織中呈高表達(dá)，其可能作為抑癌基因參與食管癌的發(fā)生和進(jìn)展，但其在食管癌中的作用機(jī)制目前尚不清楚。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O1(forkhead box transcription factor O1，F(xiàn)OXO1)是forkhead家族中一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，其主要調(diào)控細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)代謝等[7]。有報(bào)道顯示，F(xiàn)OXO1在食管癌組織中呈低表達(dá)，與患者預(yù)后不良密切相關(guān)[8]。最近有研究顯示，miR-9通過直接靶向FOXO1增強(qiáng)宮頸癌的侵襲和遷移[9]。然而，在食管癌中miR-9-5p是否靶向調(diào)控FOXO1的研究鮮有報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)探究miR-9-5p對(duì)FOXO1的調(diào)控作用及對(duì)食管癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響，以期為食管癌的早期診斷和臨床治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料人食管癌Eca-109細(xì)胞系(美國ATCC細(xì)胞庫，目錄號(hào)：FS-0228)；RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司，目錄號(hào)：61870044)；DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司，目錄號(hào)：10569044)；胎牛血清(美國Gibco公司，目錄號(hào)：12483020)；RNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，目錄號(hào)：CW0560S)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司，目錄號(hào)：6210A)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司，目錄號(hào)：RR086A)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen公司，目錄號(hào)：11668027)；miR-9-5p inhibitor、NC-inhibitor、miR-9-5p mimics和NC-mimics由廣州銳博生物科技有限公司合成；MTT試劑(美國Sigma公司，目錄號(hào)：96992)；Transwell小室(美國Corning公司，目錄號(hào)：Scipu002273)；Matrigel基質(zhì)膠(BD公司，目錄號(hào)：356235)；熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3質(zhì)粒(美國Promega公司，目錄號(hào)：E1741)；Dual-Luciferase熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(美國Promega公司，目錄號(hào)：E7110)；RIPA裂解液(上海碧云天生物科技有限公司，目錄號(hào)：P0013K)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司，目錄號(hào)：P0012S)；PVDF膜(美國Abcam公司，目錄號(hào)：ab133411)；ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(美國Thermo Fisher公司，目錄號(hào)：34094)；鼠抗人FOXO1抗體(美國CST公司，目錄號(hào)：9454)；鼠抗人GAPDH抗體(美國CST公司，目錄號(hào)：8884)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，目錄號(hào)：A24512)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染食管癌Eca-109細(xì)胞使用質(zhì)量濃度為100 g/L的滅活胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(含100 U/ml的青霉素和100 g/L鏈霉素雙抗)培養(yǎng)，置于體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，及時(shí)更換新鮮培養(yǎng)液，待細(xì)胞貼壁生長匯合度為80%以上時(shí)使用質(zhì)量濃度為2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的Eca-109細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，即轉(zhuǎn)染前1 d將Eca-109細(xì)胞接種到6孔板中，置于體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合率達(dá)50%時(shí)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將轉(zhuǎn)染miR-9-5p inhibitor的Eca-109細(xì)胞設(shè)置為anti-miR-9-5p組，將轉(zhuǎn)染NC-inhibitor的Eca-109細(xì)胞設(shè)置為NC組，將未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的Eca-109細(xì)胞設(shè)置為對(duì)照即Blank組。轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞放置于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后更換為正常完全培養(yǎng)液，于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 qRT-PCR檢測miR-9-5p和FOXO1 mRNA表達(dá)水平分別收集轉(zhuǎn)染48 h后各組Eca-109細(xì)胞，使用RNA提取試劑盒分別提取各組Eca-109細(xì)胞中總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。檢測miR-9-5p表達(dá)水平的反應(yīng)條件設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共設(shè)置40個(gè)循環(huán)。檢測FOXO1 mRNA表達(dá)水平的反應(yīng)條件設(shè)置如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共設(shè)置40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法分別計(jì)算miR-9-5p和FOXO1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。其中以β-actin為內(nèi)參計(jì)算FOXO1 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-9-5p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 MTT法檢測Eca-109細(xì)胞體外增殖能力分別收集Blank組、NC組和anti-miR-9-5p組Eca-109細(xì)胞，接種至96孔板中，接種密度為2×103個(gè)/孔，置于37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，分別于轉(zhuǎn)染0、24、48、72 h時(shí)在各孔細(xì)胞中加入10 μl MTT溶液，置常規(guī)培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，除去上清培養(yǎng)液，再在細(xì)胞中加入150 μl二甲基亞砜，振蕩反應(yīng)10 min，使用酶標(biāo)儀測定450 nm波長處各孔細(xì)胞的光密度值(OD值)。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測Eca-109細(xì)胞體外侵襲和遷移能力將Matrigel膠置于4 ℃冰箱進(jìn)行溶解，在冰上以不含血清的培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠，將稀釋的Matrigel膠加入到Transwell小室的上室，使其均勻鋪滿小室底部，置于超凈工作臺(tái)中過夜風(fēng)干。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)Transwell小室的上室不以Matrigel膠包被。Blank組、NC組和anti-miR-9-5p組Eca-109細(xì)胞培養(yǎng)24 h后用胰酶消化，并以不含血清的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，取200 μl細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室，接種密度為1.5×105個(gè)/小室，下室中加入600 μl質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，取出Transwell小室，棉簽擦去上室細(xì)胞，PBS洗滌后以質(zhì)量濃度為1 g/L結(jié)晶紫染色，在倒置顯微鏡下(100×)隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察穿膜細(xì)胞數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)采用生物信息學(xué)軟件TargetScan等數(shù)據(jù)庫分析miR-9-5p的靶基因，結(jié)果顯示FOXO1基因3′端存在miR-9-5p的潛在結(jié)合位點(diǎn)，提示FOXO1可能是miR-9-5p的直接靶基因。采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證該結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測結(jié)果，分別擴(kuò)增出含miR-9-5p結(jié)合位點(diǎn)的FOXO1 3′UTR及miR-9-5p結(jié)合位點(diǎn)突變的FOXO1 3′ UTR序列，并將其插入到熒光素酶報(bào)告基因載體上，構(gòu)建野生型FOXO1-Wt和突變型FOXO1-Mut重組質(zhì)粒。將Eca-109細(xì)胞接種到96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h，分別將FOXO1-Wt重組質(zhì)?；騀OXO1-Mut重組質(zhì)粒與miR-9-5p mimics或NC-mimics共轉(zhuǎn)染至Eca-109細(xì)胞，置于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集并裂解細(xì)胞，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒測定每孔細(xì)胞的海腎熒光素酶活性和螢火蟲熒光素酶活性，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。相對(duì)熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.7 Western blotting檢測FOXO1蛋白表達(dá)水平收集轉(zhuǎn)染48 h的Blank組、NC組和anti-miR-9-5p組Eca-109細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液于冰上提取細(xì)胞中總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量。將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，沸水浴加熱變性，取等量變性蛋白樣品加入上樣孔，行SDS-PAGE凝膠電泳。待蛋白分離后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，在質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂奶粉中封閉1 h，TBST洗膜后加入FOXO1一抗(1∶500稀釋)，4 ℃過夜雜交，TBST洗膜后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶3 000稀釋)，室溫雜交1 h，TBST洗膜后以ECL化學(xué)發(fā)光，于暗室成像拍照，以GAPDH為內(nèi)標(biāo)蛋白，使用Image J分析軟件計(jì)算各組Eca-109細(xì)胞中FOXO1蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染miR-9-5p inhibitor可下調(diào)食管癌Eca-109細(xì)胞中miR-9-5p的表達(dá)qRT-PCR分析結(jié)果顯示，anti-miR-9-5p組Eca-109細(xì)胞中miR-9-5p的表達(dá)水平顯著低于NC組和Blank組(P<0.05)，miR-9-5p在NC組和Blank組中的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖1)。

注：與Blank組相比，aP<0.05；與NC組相比，bP<0.05。圖1 各組細(xì)胞中miR-9-5p的表達(dá)Fig 1 Expression of miR-9-5p in each group

2.2 干擾miR-9-5p抑制食管癌Eca-109細(xì)胞增殖MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，anti-miR-9-5p組Eca-109細(xì)胞在24、48、72 h時(shí)OD值均明顯低于NC組和Blank組(P<0.05)，NC組和Blank組細(xì)胞OD值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表1)。

表1 干擾miR-9-5p對(duì)Eca-109細(xì)胞OD值的影響Tab 1 Effect of interference miR-9-5p on OD value of Eca-109 cells

注：與Blank組比，aP<0.05；與NC組比，bP<0.05。

2.3 干擾miR-9-5p抑制食管癌Eca-109細(xì)胞侵襲和遷移Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，anti-miR-9-5p組侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于NC組和Blank組(P<0.05)，而NC組和Blank組中侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

2.4 miR-9-5p靶向調(diào)控FOXO1的表達(dá)在線生物學(xué)軟件TargetScan預(yù)測分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO1基因3′UTR上和miR-9-5p存在潛在靶向結(jié)合位點(diǎn)(見圖3 A)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO1-Wt共轉(zhuǎn)染組中miR-9-5p組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性明顯低于NC組(P<0.05)；FOXO1-Mut共轉(zhuǎn)染組中miR-9-5p組和NC組相對(duì)熒光素酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖3B)。qRT-PCR和Western blotting方法檢測干擾miR-9-5p對(duì)細(xì)胞中FOXO1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，anti-miR-9-5p組Eca-109細(xì)胞中FOXO1 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯高于NC組(P<0.05)(見圖3C～3D)。

表2 干擾miR-9-5p對(duì)Eca-109細(xì)胞侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)的影響Tab 2 Effects of interference miR-9-5p on cell invasion and migration of Eca-109 cells

注：與Blank組相比，aP<0.05；與NC組相比，bP<0.05。

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測Eca-109細(xì)胞遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，100×)Fig 2 Transwell assay for migration and invasion of Eca-109 cells (crystal violet staining, 100×)

注：與NC組相比，bP<0.05。

圖3 miR-9-5p靶向調(diào)控FOXO1的表達(dá)A：miR-9-5p和FOXO1基因3′UTR存在靶向結(jié)合位點(diǎn)；B：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證FOXO1是miR-9-5p的靶基因；C～D：qRT-PCR和Western blotting方法檢測細(xì)胞中FOXO1 mRNA和蛋白表達(dá)

Fig 3 Expression of FOXO1 by miR-9-5p target regulationA: target binding sites in miR-9-5p and FOXO1 gene 3′UTR; B: FOXO1 was the target gene of miR-9-5p verified by double luciferase reporting gene experiment; C-D: expressions of FOXO1 mRNA and protein detected by qRT-PCR and Western blotting

2.5 Western blotting方法檢測FOXO1蛋白表達(dá)水平Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， Western blotting方法檢測干擾miR-9-5p對(duì)細(xì)胞中FOXO1 蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，anti-miR-9-5p組Eca-109細(xì)胞中FOXO1蛋白表達(dá)水平明顯高于NC組(P<0.05)(見圖4、表3)。

注：與NC組相比，bP<0.05。圖4 干擾miR-9-5p對(duì)細(xì)胞中FOXO1蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Effect of interference miR-9-5p on expression ofFOXO1 protein in cells

FOXO1蛋白相對(duì)表達(dá)量123平均值SD值NC組0.6530.6600.6610.6580.0047anti-miR-9組1.1631.1661.1701.1660.0033

3 討論

越來越多的研究表明，miRNA參與各種生物過程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡、代謝和腫瘤發(fā)生[10-11]。眾所周知，miRNA可以參與調(diào)節(jié)人類疾病的起始和維持多種基因的表達(dá)。近年來，多項(xiàng)研究報(bào)道了多種miRNA參與食管癌的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，然而其具體作用機(jī)制尚不十分明確[12-13]。目前研究發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p能夠參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如在乳腺癌中，miR-9-5p能夠通過介導(dǎo)細(xì)胞中AR-an癌基因的表達(dá)抑制乳腺癌的進(jìn)展[14]。GAO等[15]研究顯示，miR-9-5p在胃癌組織和細(xì)胞中呈低表達(dá)，miR-9-5p干擾能夠在體外抑制胃癌細(xì)胞增殖，體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了干擾miR-9-5p抑制腫瘤的生長。miR-9-5p抑制人卵巢癌OVCAR-3細(xì)胞的細(xì)胞增殖，抑制侵襲能力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，該過程通過靶向SDF-1/CXCR4通路實(shí)現(xiàn)的[16]。目前研究發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p在食管癌中呈低表達(dá)，因此本研究首先在食管癌Eca-109細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-9-5p inhibitor干擾miR-9-5p，qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證了轉(zhuǎn)染miR-9-5p inhibitor能夠上調(diào)Eca-109細(xì)胞中miR-9-5p的表達(dá)。MTT檢測發(fā)現(xiàn)，干擾miR-9-5p能夠抑制Eca-109細(xì)胞體外增殖能力。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾miR-9-5p能夠抑制Eca-109細(xì)胞體外侵襲和遷移能力。這與以往關(guān)于miR-9-5p發(fā)揮抑癌基因功能的研究相符。隨著對(duì)miR-9-5p研究的深入，發(fā)現(xiàn)miR-9-5p在肺癌組織和細(xì)胞中呈高表達(dá)，體外研究發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p可通過抑制TGFBR2促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[17]。miR-9-5p在宮頸癌組織標(biāo)本中的表達(dá)顯著高于鄰近正常組織，可作為宮頸癌患者潛在的預(yù)后標(biāo)志物[18]。miR-9-5p在自發(fā)性犬骨肉瘤中干擾，并介導(dǎo)凝溶膠蛋白(GSN)的表達(dá)促進(jìn)轉(zhuǎn)移表型，包括成骨細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[19]。這些研究顯示miR-9-5p發(fā)揮促癌基因的作用。提示miR-9-5p在不同腫瘤中可能通過介導(dǎo)不同靶基因發(fā)揮促癌基因或抑癌基因的作用。

FOXO1轉(zhuǎn)錄因子是FOX家族重要成員之一，目前研究顯示FOXO1與多種惡性腫瘤形成、生長及浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，CHAN等[20]研究表明，F(xiàn)OXO1可抑制口腔癌細(xì)胞生長、集落形成和侵襲能力，HBP1作為口腔癌中FOXO1的直接下游靶標(biāo)，HBP1敲低有效促進(jìn)口腔癌的惡性表型。ZANG等[21]研究發(fā)現(xiàn)，miR-215通過直接結(jié)合FOXO1的3′UTR來降低FOXO1的表達(dá)，miR-215通過靶向FOXO1促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。miR-196a的下調(diào)通過靶向FOXO1抑制人肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-9通過下調(diào)FOXO1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[22]。提示miR-9-5p可能與FOXO1存在靶向關(guān)系。因此本實(shí)驗(yàn)通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-9-5p的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOXO1基因3′ UTR與miR-9-5p存在互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)，表明FOXO1可能是miR-9-5p的直接靶基因，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-9-5p能夠與FOXO1靶向結(jié)合。接下來本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR和Western blotting方法檢測干擾miR-9-5p對(duì)細(xì)胞中FOXO1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，干擾miR-9-5p能夠抑制FOXO1 mRNA和蛋白的表達(dá)，這表明miR-9-5p能夠負(fù)向調(diào)控FOXO1的表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，miR-9-5p在食管癌中的抑癌基因的作用可能通過靶向FOXO1實(shí)現(xiàn)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾食管癌Eca-109細(xì)胞中miR-9-5p的表達(dá)可抑制細(xì)胞體外增殖、侵襲和遷移能力，該過程可能通過靶向負(fù)調(diào)控FOXO1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。隨著對(duì)miR-9-5p研究的深入，miR-9-5p有望成為食管癌早期診斷和臨床治療的分子靶向。