賈 瑋，劉余陽，石 琳，許秀麗，儲曉剛,

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021;2.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123)

葛根是豆科葛屬野葛或粉葛的干燥根，具有降低血糖、血脂以及解酒、抗癌、護(hù)肝，兼有辛溫、祛風(fēng)寒的作用[1-5]，其主要活性成分為葛根素(Puerarin)、大豆苷元(Daidzein)、染料木苷(Genistin)等異黃酮類化合物[6-9]。其中，葛根素具有抗細(xì)胞凋亡作用，可減輕多種細(xì)胞的凋亡，包括神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和心肌細(xì)胞[10-14]。葛根具有良好的藥用及保健價值，目前葛根產(chǎn)品的開發(fā)利用多為臨床用藥、保健食品以及飼料加工。

產(chǎn)品的多樣性以及高需求量帶來了針對其功效成分的高通量快速篩查方法需求[15]。近年來，針對葛根及其相關(guān)產(chǎn)品中葛根素和其他異黃酮類化合物的定性、定量方法有多種[16]，如采用高效液相色譜法測定藥品中葛根素等4種異黃酮含量[17]，利用電化學(xué)方法檢測葛根素[18]，采用酶聯(lián)免疫吸附法快速評價葛根藥材質(zhì)量[19]，而非定向篩查方法應(yīng)用于葛根保健品的相關(guān)研究未見報道。非定向篩查是在定向篩查建立數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，通過數(shù)據(jù)挖掘來篩查定向目標(biāo)物及其以外的化合物，并進(jìn)行篩選確證[20-21]。質(zhì)譜的掃描范圍相對較寬，可實(shí)現(xiàn)對多種物質(zhì)的篩選、定性與定量分析，為非定向篩查奠定了基礎(chǔ)。目前，基于質(zhì)譜的非定向篩查方法廣泛應(yīng)用于食品中污染物質(zhì)、農(nóng)獸藥殘留以及毒素的定性與定量分析。將非定向篩查方法應(yīng)用于食品中危害物的判別，是我國“十三五”規(guī)劃前沿關(guān)鍵技術(shù)之一。

本研究通過超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Orbitrap HRMS)對葛根保健品中已知功效成分的斷裂機(jī)理以及碎裂片段特征進(jìn)行研究，建立了一種非定向篩查方式，并采用Full MS/dd-MS2掃描模式建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)譜庫，采用數(shù)據(jù)非依賴型采集模式(vDIA)對樣品成分進(jìn)行分析。該方法可為葛根保健品中未知功效成分的檢測提供技術(shù)依據(jù)，同時還可應(yīng)用于其他食品中未知成分的檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀和UPLC-ESI-Orbitrap HRMS系統(tǒng)(美國Thermo-Fisher Scientific公司);高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司);Milli-R04 純水儀(德國Millipore公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器有限公司)。甲醇(質(zhì)譜純，美國Fisher公司)；葛根固體飲料樣品(陜西華健漢菖生物科技有限責(zé)任公司)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：3′-羥基葛根素、4′-O-甲基葛根素、葛根素-6″-O-木糖苷、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、黃豆黃苷、黃豆黃素、染料木苷、芒柄花苷、染料木素、芒柄花黃素、柚皮苷、柚皮素、橙皮素、橙皮苷(美國Sigma-Aldrich公司)。

1.2 溶液制備

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制分別準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品0.001 g于10 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容，配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。?5種標(biāo)準(zhǔn)儲備液各5 μL，混勻后即得質(zhì)量濃度為 100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 樣品的處理準(zhǔn)確稱取2.0 g(精確至0.01 g)葛根固體飲料粉末，加至10 mL 70%甲醇溶液中，超聲振蕩提取30 min后過濾紙，將沉淀物加至70%甲醇溶液中，再次超聲振蕩提取，過濾。合并兩次提取液冷卻至室溫后，以10 000 r/min冷凍離心30 min，取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，待進(jìn)樣分析。

1.3 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為Accucore aQ液相色譜柱(150 mm×2.1 mm，2.6 μm，美國Thermo-Fisher Scientific公司)；流速：0.3 mL/min；流動相：A為甲醇，B為水。梯度洗脫程序：0～3 min，0%～30% A；3～5 min，30% A；5～10 min，30%～70% A；10～12 min，70% A；12～12.1 min，70%～0% A；12.1～15 min，0% A。柱溫：30 ℃，進(jìn)樣體積：5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)，正離子模式；全掃描模式(Full MS)以及數(shù)據(jù)非依賴型采集模式(Data independent acquisition,vDIA)；碰撞氣體：N2；離子源溫度：350 ℃；毛細(xì)管電壓:3.5 kV；質(zhì)量掃描范圍:m/z50.0～750.0，鞘氣流速:14.4 L/min，輔助氣流速:30 L/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 功效成分標(biāo)準(zhǔn)譜庫的建立

將100 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋配制成500 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于標(biāo)準(zhǔn)譜庫的建立。運(yùn)用Full MS/dd-MS2掃描模式建立標(biāo)準(zhǔn)譜庫，采集功效成分的分子離子的質(zhì)荷比(理論值)、二級碎裂片段的質(zhì)荷比與保留時間。所有功效成分標(biāo)準(zhǔn)譜庫的信息均使用Exact Finder1.0軟件(美國Thermo-Fisher Scientific公司)進(jìn)行管理且在樣品篩查時用于數(shù)據(jù)分析。

2.1.1 分子離子的主要離子化形式為確保色譜保留時間與分子離子在質(zhì)譜中空間信息的準(zhǔn)確性及重現(xiàn)性，每個功效成分進(jìn)樣6次，并使用Xcalibur軟件選取與理論值偏差小且質(zhì)量精度高的一級分子離子的準(zhǔn)確離子化形式。電噴霧有正、負(fù)電離模式，如[M-HCOO]-、[M-H]-、[M+NH4]+、[M+Na]+、[M+H]+等，在本實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的分子離子以[M+H]+為主。

2.1.2 二級斷裂碎片的理論值利用密度泛函理論，并結(jié)合Mass Frontier 7.0軟件(美國Thermo-Fisher Scientific公司)預(yù)測結(jié)果，對功效成分的裂解途徑進(jìn)行分析。篩選dd-MS2模式獲取響應(yīng)值高且有特征性的碎裂片段，基于元素構(gòu)成閾值計算質(zhì)譜裂解反應(yīng)生成片段的理論值，建立化合物標(biāo)準(zhǔn)譜庫(Library)。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)譜庫信息的管理葛根保健品中部分功效成分的標(biāo)準(zhǔn)譜庫使用mzVault軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)管理，可以進(jìn)行化合物名稱、CAS號、分子式、質(zhì)荷比等的譜圖檢索。表1列出了15種功效成分的標(biāo)準(zhǔn)譜庫信息。

表1 葛根保健品中15種功效成分的標(biāo)準(zhǔn)譜庫信息Table 1 Standard library parameters of 15 functional components in food supplements of pueraria

*no data

2.2 片段斷裂特征及其在物質(zhì)篩查中的作用

2.2.1 斷裂機(jī)理研究葛根保健品中的功效成分多為異黃酮與黃烷酮類化合物[9]。在ESI正離子模式下，異黃酮類化合物通常在母核的環(huán)狀結(jié)構(gòu)上發(fā)生質(zhì)譜裂解。以3′-羥基葛根素為例，其分子離子峰為m/z433.112 92[M+H]+，質(zhì)譜碎裂途徑如圖1所示。在圖2所示的途徑中，該化合物經(jīng)γ-H重排轉(zhuǎn)移電荷中心，在正離子模式下準(zhǔn)分子離子峰m/z433.112 92[M+H]+脫去1分子C4H11O4形成碎片離子m/z311.055 01[M+H-C4H11O4]+，之后再脫去1分子CO得到碎片離子m/z283.060 10[M+H-C4H11O4-CO]+；或經(jīng)i斷裂與γ-H重排后脫去1分子C5H11O5得到碎片離子m/z283.060 10[M+H-C5H11O5]+。

2.2.2 片段斷裂特征以黃烷酮類中的柚皮苷為例，其分子式為C27H32O14，是黃酮類化合物的衍生物，具有黃酮類化合物的母核2-苯基色原酮(C15H10O2)。通過對黃烷酮結(jié)構(gòu)的研究，推測其片段斷裂機(jī)理，發(fā)現(xiàn)橙皮苷、柚皮苷、橙皮素等化合物均有碎片C7H5O4(m/z153.081 24)，可知其為該類化合物共有的碎裂片段，可用于該類化合物的篩查。質(zhì)譜裂解反應(yīng)機(jī)理為電子轉(zhuǎn)移規(guī)律，基本類型包括電荷中心的轉(zhuǎn)移、游離基的轉(zhuǎn)移、重排反應(yīng)和簡單鍵斷裂(α、β、σ等斷裂)。實(shí)驗(yàn)采用相同的碰撞能，將化合物的分子離子與高純度氮?dú)馀鲎?，得到穩(wěn)定的二級譜圖，碎片信息較完善，隨后可通過分子離子質(zhì)荷比、碎片離子質(zhì)荷比等已有的信息找出特征碎裂片段。通過對已有標(biāo)準(zhǔn)品碎裂片段斷裂機(jī)理的研究，并結(jié)合該化合物的結(jié)構(gòu)，推斷出功效成分的特征碎裂片段，用于未知化合物的篩查。表2列出了異黃酮類與黃烷酮類化合物的特征碎裂片段。

圖1 3′-羥基葛根素可能的裂解途徑Fig.1 Proposed fragmentation pathway of 3′-hydroxy puerarin

CategoryFormulaofcharacteristicfragmentStructuralformulaTheoreticalmass-to-chargeratio(m/z)Isoflavones(異黃酮類)C20H15O6351.08631C16H13O4269.08084

(續(xù)表2)

CategoryFormulaofcharacteristicfragmentStructuralformulaTheoreticalmass-to-chargeratio(m/z)Flavanones(黃烷酮類)C7H5O3137.02332C16H15O6303.08631

2.2.3 特征斷裂片段在功效成分篩查中的應(yīng)用基于功效成分的特征斷裂片段信息實(shí)現(xiàn)未知功效成分的篩查。首先，運(yùn)用vDIA掃描模式獲取保健品樣品的質(zhì)譜信息，利用功效成分碎裂片段的精確質(zhì)量數(shù)列表進(jìn)行提峰；然后，將捕集到的呈高斯分布且數(shù)據(jù)點(diǎn)大于10的色譜峰進(jìn)行匯總，并與功效成分標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)信息進(jìn)行比對，明確未知化合物的歸類；其次，通過分析質(zhì)譜裂解途徑、分子離子與碎裂片段信息確定未知化合物的元素組成與分子式；最后，利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行確證并進(jìn)行定量。

圖3 芒柄花苷的高分辨質(zhì)譜圖Fig.3 HRMS spectrum of ononin

例如，在篩查樣品中的功效成分時，利用異黃酮類與黃烷酮類的特征斷裂片段(表2),從總離子流圖中提取出色譜質(zhì)譜信息(如圖3)，例如1個碎裂片段m/z269.080 20與表2中異黃酮類的特征碎裂片段m/z269.080 84具有相同的質(zhì)譜裂解途徑，可判斷該化合物為異黃酮類，結(jié)合分子離子與其相應(yīng)碎裂片段的精確質(zhì)量數(shù)、分子離子峰與其同位素的響應(yīng)強(qiáng)度比值、分子離子峰與其相應(yīng)碎裂片段的響應(yīng)強(qiáng)度比值，確定該化合物分子式為C22H22O9。利用密度泛函理論分析該物質(zhì)的斷裂途徑，并與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫信息比對，發(fā)現(xiàn)該未知化合物的碎裂片段斷裂機(jī)理與芒柄花黃素相同，通過與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的色譜質(zhì)譜信息匹配，最終確定該化合物為芒柄花苷。

2.3 篩查方法的建立

篩查流程包括篩選與確證，判定依據(jù)為功效成分的標(biāo)準(zhǔn)譜庫與其相應(yīng)的化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。第一步，按照已優(yōu)化方法對葛根保健品進(jìn)行處理和檢測，質(zhì)譜掃描方式為數(shù)據(jù)可溯源的Full MS/vDIA；第二步，加載數(shù)據(jù)庫；第三步，加載篩查方法；第四步，分析數(shù)據(jù)。

運(yùn)用Exact Finder軟件，對全掃描圖與二級碎裂片段譜圖進(jìn)行處理，提取出化合物信息。峰面積閾值(Peak area threshold)設(shè)為Full MS/vDIA掃描模式對分子離子峰碎裂閾值的響應(yīng)強(qiáng)度8.3×104。對于初步判斷為功效成分的化合物進(jìn)行特征斷裂片段的提取與分析，進(jìn)而得到結(jié)論。

通過同位素離子峰信息與二級碎裂片段豐度比進(jìn)行確證，其中色譜共流出的同分異構(gòu)體是確證難點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)中葛根素-6″-O-木糖苷與葛根素芹菜糖苷的保留時間均為5.0 min，分子離子的質(zhì)荷比均為549.160 27，其碎裂片段相同，但豐度比不同，可通過質(zhì)荷比為313.069 76與351.085 38兩個碎裂片段的響應(yīng)強(qiáng)度比值進(jìn)行區(qū)別與確證(如圖4)。功效成分的主要組成元素(如C、H、O)具有同位素，如具有M+1特征(比分子離子多1個質(zhì)量單位的峰)的13C。分子離子為天然豐度最高的同位素組合的離子，質(zhì)譜上與之相對應(yīng)的具有相同元素的其他同位素組成的離子峰稱為同位素離子峰。分子離子峰與同位素離子峰的豐度比可應(yīng)用于確證，如含有1個碳原子時，響應(yīng)強(qiáng)度比[M]/[M+1]=100/1.1，當(dāng)分子式中含有n個這類原子時，運(yùn)用二項式(a+b)n計算同位素相對豐度。如圖5，通過對比葛根素-6″-O-木糖苷的M+113C豐度比的理論值與實(shí)際值進(jìn)行確證。分子離子峰與同位素離子峰豐度比的允許閾值(Allowed intensity deviation)設(shè)為10%。

圖4 同分異構(gòu)體葛根素-6″-O-木糖苷(A)與葛根素芹菜糖苷(B)的全掃描與二級碎裂片段比對Fig.4 Comparison of full scan and secondary fragmentation of puerarin-6″-O-xyloside(A) and mirificin(B) isomer

圖5 葛根素-6″-O-木糖苷分子離子峰與同位素離子峰的理論值(A)與實(shí)際值(B)確證Fig.5 Theoretical(A) and experimental (B)spectra of puerarin 6″-O-xyloside

2.4 方法參數(shù)及樣品檢測

2.4.1 線性關(guān)系將15種功效成分的標(biāo)準(zhǔn)儲備液用甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用所建方法對稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測定，以峰面積與對應(yīng)質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由表3可知，15種標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99。

2.4.2 靈敏度、回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差向空白樣品中加入15種物質(zhì)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同的篩查條件下進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個加標(biāo)水平進(jìn)行6次測定。根據(jù)歐盟2002/657/EC相關(guān)規(guī)定，采用確定限(CCα)與檢測容量(CCβ)表示方法的靈敏度。由表3可知，15種化合物的CCα為0.01～1.15 μg/kg,CCβ為0.01～2.03 μg/kg;不同加標(biāo)水平下的回收率為83%～110%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.1%～8.6%。

2.4.3 實(shí)際樣品檢測應(yīng)用所建方法對樣品中的功效成分進(jìn)行定性定量，庫外成分的定量是根據(jù)色譜峰面積以及黃酮總量計算得到(見表4)。結(jié)果顯示，在樣品中共檢出16種物質(zhì)，RSD均小于2.0%，運(yùn)用所建方法篩查到的葛根素、大豆苷元、鳶尾苷、大豆苷4種物質(zhì)為所建譜庫外化合物，表明所建方法可行且有效。

表3 15種標(biāo)準(zhǔn)品的線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r2)、確定限(CCα)、檢測容量(CCβ)、 回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Linear ranges,correlation coefficients(r2)，CCα,CCβ,recoveries and relative standard deviations of 15 standards(n=6)

表4 樣品中功能成分的定性定量檢測結(jié)果(n=3)Table 4 Qualitative and quantitative results of functional components in food supplements of pueraria(n=3)

3 結(jié) 論

本研究通過建立標(biāo)準(zhǔn)譜庫，結(jié)合二級質(zhì)譜信息，以及對葛根保健品中可能存在的功效成分?jǐn)嗔褭C(jī)理進(jìn)行研究，采用UPLC-Q-Orbitrap HRMS建立快速測定葛根保健品中功效成分的方法，達(dá)到了非定向篩查目的，并得到兩類功效成分的特征質(zhì)譜碎裂片段(異黃酮類：m/z351.086 31，m/z269.080 84；黃烷酮類：m/z137.023 32，m/z303.086 31)，為檢測葛根相關(guān)保健品中功效成分提供理論依據(jù)。實(shí)際樣品檢測結(jié)果顯示，不但檢出所建標(biāo)準(zhǔn)譜庫中的12種物質(zhì)，同時篩查出庫外4種功效成分。所建方法可用于葛根保健品中未知功效成分的檢測，同時也有望應(yīng)用于其他食品中未知成分的檢測。