陳英 鐘雅靜 曾欽 羅麗

舌鱗狀細胞癌(tongue squamous cell carcinoma，TSCC)為常見的惡性腫瘤之一，多呈侵襲性生長，TSCC患者治療后腫瘤極易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[1-2]。遏制TSCC轉(zhuǎn)移是臨床治療OSCC亟待解決的問題。17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)是人體尤其是女性體內(nèi)重要的性激素，主要通過雌激素受體(estrogen receptor，ER)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[3-4]。E2還可以調(diào)節(jié)雌激素相關(guān)受體(estrogen-related receptor alpha，ERRα)表達從而調(diào)控腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為[5]。ERRα是孤兒核受體家族的成員，其在惡性腫瘤遷移和侵襲中發(fā)揮一定作用[6-7]。但ERRα下游信號機制還有待于進一步研究。本研究以人舌鱗癌TCA8113細胞為研究模型，E2刺激模型細胞，觀察細胞侵襲能力的變化，探討ERRα及其下游信號在其中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 人口腔鱗癌Tca8113細胞(中國科學(xué)院上海細胞庫)。

1.1.2 試劑 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、 磷酸鹽緩沖液(PBS)(Gibco公司， 美國)； 總蛋白提取試劑盒和細胞裂解液(上海碧云天公司)；FN siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒(上海吉瑪公司)； 抗FN抗體(sc-69681，Santa Cruz公司， 美國)；抗GAPDH抗體(AP0063，內(nèi)參)、羊抗小鼠IgG-HRP(BS13278)(南京巴傲得公司)； 聚偏二氟乙烯膜(PVDF)(Millipore公司， 美國)。

1.1.3 儀器 移液器(Gilson公司， 法國)； CKX41倒置顯微鏡(Olympus公司， 日本)； Allegra 64R Centrifuge臺式高速冷凍離心機(Beckman Coulter公司, 美國)； SW-CJ-2FD超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)； DYY-7C電泳儀(GE公司, 美國)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 以含12% FBS及1%青鏈霉素的RPMI 1640高糖培養(yǎng)基于37 ℃、 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞，生長至70%匯合度進行傳代。

1.2.2 侵襲小室實驗 實驗前拿出Matrigel膠放于冰上融化，用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋Matrigel膠至濃度為250 μg/ml。準備好transwell侵襲小室(規(guī)格：24 孔； 孔徑： 8 μm)，吸取稀釋好的培養(yǎng)基基質(zhì)膠混合物100 μl于小室中，避免打入氣泡。將培養(yǎng)板放置到培養(yǎng)箱靜置3 h。 將同步化24 h的Tca8113細胞或FN siRNA處理過的Tca8113細胞消化制成細胞懸液并調(diào)整細胞密度至1×106個/ml， 吸取混合均勻的細胞懸液200 μl輕輕加入Transwell小室。在小室外的24 孔板下室中加入800 μl含趨化因子及高濃度FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，放置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。 24 h后倒掉侵襲小室中的培養(yǎng)基并用PBS洗2 遍，甲醇固定20 min， PBS洗2 遍，放入到0.5%結(jié)晶紫水溶液中染色20 min，PBS洗2 遍，用棉簽輕輕擦掉小室內(nèi)房細胞，放置5～10 min風(fēng)干。倒置顯微鏡下觀察并取6 個視野拍照并計數(shù)，計算侵襲率。

1.2.3 蛋白印跡檢測蛋白表達 用總蛋白提取試劑RIPA細胞裂解液(使用前20 min加蛋白酶抑制劑，使其終濃度為1 mmol/L)裂解細胞， 12 000 r/min離心20 min，吸取上清，采用BCA試劑盒蛋白定量，計算并制備樣品。進行蛋白印記檢測，每泳道上樣量為30 μg， SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后將分離蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；配制5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h，TBST緩沖液洗膜3 次，每次15 min；然后按要求加入FN抗體(1∶ 1 000)4 ℃孵育過夜。一抗處理后，TBST洗膜3 次，再加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標記二抗(1∶2 000)，室溫雜交1 h，PVDF膜以化學(xué)發(fā)光試劑盒進行顯色，凝膠成像儀進行成像，以imageJ對蛋白印跡條帶進行處理和分析。

1.2.4 FN siRNA轉(zhuǎn)染沉默F(xiàn)N蛋白表達 轉(zhuǎn)染前24 h用1 ml 高糖 1640全培養(yǎng)基將模型細胞接種在6 孔板上，每孔4×105個細胞，細胞匯合度達到70%～90%時，更換培養(yǎng)基。siRNA的轉(zhuǎn)染濃度為60 pmol/ml，提前準備配制siRNA-lipo2000混和液，預(yù)先將lipo2000試劑輕輕搖勻，按需取出適量，用高糖1640培養(yǎng)基稀釋并輕輕混和，常溫放置5 min；高糖1640培養(yǎng)基稀釋siRNA，輕輕混和；將稀釋好的lipo2000與稀釋好的siRNA混和并輕輕混勻，常溫放置20 min以形成siRNA-lipo2000混和物。將相應(yīng)siRNA-lipo2000混和液加入含有細胞以及培養(yǎng)液的6 孔板中，十字搖晃混和。置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中24 h后進行后續(xù)實驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 E2增強TCA8113細胞侵襲能力

以1‰體積的DMSO處理TCA8113細胞并作為對照， 1‰體積的E2(100 nmol/L)處理TCA8113細胞24 h， 兩處理組侵襲細胞數(shù)分別為(51.5±4.1) 個和(73.7±4.7) 個(P<0.01)(圖 1)。

圖 1 E2對TCA8113細胞侵襲能力的影響

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Fig 1 The effect of E2 on the invasion of TCA8113 cells

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2.2 E2增強TCA8113細胞FN蛋白表達水平

以1‰體積的DMSO處理TCA8113細胞并作為對照， 1‰體積的E2處理TCA8113細胞24 h能顯著上調(diào)FN蛋白表達水平(48.2±7.8)%(P<0.01)(圖 2)。

2.3 ERRα特異性抑制劑XCT-790逆轉(zhuǎn)E2對TCA8113細胞FN表達的影響

分別以1‰ DMSO和1‰ ERRα特異性抑制劑XCT-790(1 μmol/ml)預(yù)處理TCA8113細胞，然后以E2刺激細胞24 h， 結(jié)果顯示XCT-790預(yù)處理可顯著抑制E2誘導(dǎo)的FN表達上調(diào)，與DMSO預(yù)處理相比，XCT-790預(yù)處理后TCA8113細胞FN表達下調(diào)(53.3±7.2)%(P<0.01)(圖 3)。

圖 2 E2對TCA8113細胞FN蛋白表達的影響

圖 3 XCT-790對E2誘導(dǎo)的FN表達上調(diào)的影響

2.4 siRNA轉(zhuǎn)染高效沉默F(xiàn)N蛋白表達

轉(zhuǎn)染對照組與未轉(zhuǎn)染模型細胞FN表達無明顯差異， FN siRNA轉(zhuǎn)染細胞FN蛋白表達明顯降低(91.3±3.6)%(P<0.01)(圖 4)。

2.5 FN siRNA轉(zhuǎn)染抑制E2對FN表達的誘導(dǎo)

siRNA轉(zhuǎn)染沉默F(xiàn)N蛋白表達后，E2處理siRNA轉(zhuǎn)染對照細胞和siRNA轉(zhuǎn)染沉默F(xiàn)N細胞24 h，結(jié)果顯示，與siRNA轉(zhuǎn)染對照細胞相比，siRNA轉(zhuǎn)染沉默F(xiàn)N細胞蛋白表達明顯下調(diào)(88.9±6.7)%(P<0.01)。 提示， siRNA轉(zhuǎn)染沉默F(xiàn)N蛋白表達可明顯抑制E2對FN表達的誘導(dǎo)(圖 5)。

2.6 XCT-790預(yù)處理或siRNA干擾TCA8113細胞FN蛋白表達均抑制E2誘導(dǎo)的侵襲活動

分別以E2 刺激DMSO預(yù)處理的未轉(zhuǎn)染模型細胞、siRNA轉(zhuǎn)染對照細胞、XCT-790預(yù)處理的未轉(zhuǎn)染模型細胞及siRNA轉(zhuǎn)染沉默F(xiàn)N細胞，各組細胞侵襲數(shù)分別為(102.6±9.3) 個、 (96.8±8.7) 個、 (51.1±5.6) 個、 (40.5±4.2) 個。 與DMSO預(yù)處理的未轉(zhuǎn)染模型細胞相比，XCT-790預(yù)處理的未轉(zhuǎn)染模型細胞侵襲率明顯降低(50.2±4.4)%(P<0.01)；與siRNA轉(zhuǎn)染對照細胞相比，siRNA轉(zhuǎn)染沉默F(xiàn)N細胞侵襲率顯著降低(61.3±5.8)%(P<0.01)(圖 6)。

A: 模型細胞； B: FN siRNA對照細胞； C: FN siRNA轉(zhuǎn)染細胞

圖 4 siRNA轉(zhuǎn)染沉默F(xiàn)N蛋白表達

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A: Model cells; B: Control cells for siRNA transfection; C： FN siRNA transfected cells

Fig 4 Silencing of FN protein expression by FN siRNA

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A： 模型細胞； B： FN siRNA對照細胞； C： FN siRNA轉(zhuǎn)染E2預(yù)處理的細胞

圖 5 siRNA轉(zhuǎn)染抑制E2對FN蛋白表達的誘導(dǎo)

A: Model cells; B: Control cells for siRNA transfection; C: siRNA transfected cells with E2 pretreatment

Fig 5 Inhibition of E2 induced FN protein expresion by FN siRNA

3 討 論

纖連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是存在于多種動物細胞表面的大分子細胞外膜蛋白，是細胞外基質(zhì)和基底膜中的主要非膠原性糖蛋白， 在細胞黏附中起重要作用，可調(diào)節(jié)細胞極性、分化和生長[8-9]。業(yè)已證明FN參與包括舌鱗癌在內(nèi)的惡性腫瘤細胞的遷移和侵襲活動[8，10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)E2能增強TCA8113細胞FN蛋白表達和侵襲活動。提示E2增強TCA8113細胞侵襲活動可能與FN表達上調(diào)有關(guān)。進一步實驗，本研究發(fā)現(xiàn)siRNA轉(zhuǎn)染沉默F(xiàn)N蛋白表達能抑制E2對TCA8113細胞侵襲能力的影響。這些提示，E2通過上調(diào)FN蛋白表達增強TCA8113細胞侵襲活動。研究顯示，雙酚S能通過ERRα調(diào)節(jié)FN和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2和MMP-9)表達，從而促進嗜鉻細胞瘤PC12細胞遷移和侵襲[7]。提示，腫瘤細胞內(nèi)存在ERRα-FN信號通路。為此，本研究觀察了ERRα抑制劑XCT-790預(yù)處理對E2誘導(dǎo)效應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，XCT-790預(yù)處理能顯著抑制E2誘導(dǎo)的TCA8113細胞侵襲和FN表達上調(diào)。提示ERRα參與E2對TCA8113細胞侵襲活動和FN蛋白表達的調(diào)控。

A: DMSO預(yù)處理的模型細胞； B: siRNA轉(zhuǎn)染對照細胞； C: XCT-790預(yù)處理的模型細胞； D: FN siRNA轉(zhuǎn)染細胞

圖 6 XCT-790預(yù)處理或FN沉默在E2誘導(dǎo)TCA8113細胞侵襲中的作用

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A: DMSO pretreated model cells; B: Control cells for siRNA transfection; C: XCT-790 pretreated model cells; D: FN siRNA transfected cells

Fig 6 The role of XCT-790 pretreatment or FN silencing in E2-induced invasion of TCA8113 cells

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綜上所述，E2能誘導(dǎo)人舌鱗癌細胞侵襲能力增強，該作用與ERRα-FN信號通路有關(guān)。腫瘤細胞轉(zhuǎn)移包括細胞從原發(fā)部位脫落、遷移、黏附、侵襲和血管生成等[12-13]。侵襲是腫瘤轉(zhuǎn)移的必要條件之一，本研究發(fā)現(xiàn)E2通過ERRα-FN信號通路促進舌鱗癌細胞侵襲，因此，抑制ERRα-FN信號通路可能會抵抗人體內(nèi)E2的誘導(dǎo)效應(yīng)，遏制舌鱗癌的轉(zhuǎn)移。