吳建慧 牛 喆 蘭 鳳 張 靜

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

露地菊(ChrysanthemummorifoliumRamat.)是由張敩方教授將小菊類引種到黑龍江省，經(jīng)過天然雜交和衛(wèi)星搭載，培育出的適合本地栽植，能露地越冬的菊花新品種[1-2]。露地菊其植株低矮、花期長、花色豐富，是我國北方秋季主要的露地觀賞花卉[3]。此外，露地菊還具有抗性強(qiáng)、管理粗放等特點(diǎn)，已成為華北和東北地區(qū)園林綠化建設(shè)中重要的地被植物[4]。

60Co-γ射線是通過一定劑量的射線輻照，使生物體發(fā)生遺傳變異，從中選擇培育新品種的誘變技術(shù)[5]。與其他育種手段相比，γ射線具有穿透性強(qiáng)，變異范圍大，產(chǎn)生的變異穩(wěn)定快速，能極大縮短育種周期等優(yōu)點(diǎn)[6-8]。目前已廣泛應(yīng)用于作物、觀賞植物等誘變育種[9-13]。前人對菊花輻射誘變進(jìn)行了大量研究，但多集中于研究輻射后代的形態(tài)指標(biāo)、目標(biāo)性狀變異情況[14-17]、探索適宜的輻照劑量等方面[18]，而鮮見對輻射后菊花的生理生化及損傷機(jī)理的研究報(bào)道。

本研究采用不同劑量60Co-γ射線輻射露地菊生根腳芽，研究經(jīng)不同輻照處理后的露地菊葉片葉綠素含量、蛋白質(zhì)含量、脯氨酸含量、丙二醛含量、過氧化物酶活性等的變化情況，以期為露地菊輻射誘變育種提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2015年10月在東北林業(yè)大學(xué)苗圃試驗(yàn)基地選取生長一致、發(fā)育正常的露地菊品種東林瑞雪和粉翎腳芽進(jìn)行扦插生根繁殖。將扦插生根20 d后的露地菊腳芽在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米所進(jìn)行60Co-γ射線輻照處理(輻照時(shí)用鉛磚擋住扦插苗的根部)，設(shè)0(CK)、15、20、25、30、35 Gy 6個(gè)處理(輻照劑量率為0.9 Gy·min-1)，每處理各輻照30株，設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。經(jīng)輻照處理后的露地菊采用盆栽育苗(基質(zhì)以腐葉土、珍珠巖和中砂按照4∶1∶1的體積比混合)[19]。2016年4月分別采取經(jīng)不同輻照處理下東林瑞雪和粉翎的葉片，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

參照李合生[20]的方法，葉綠素含量采用乙醇浸提法測定；蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測定；游離脯氨酸含量采用茚三酮法測定；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法測定；過氧化物酶(peroxidase，POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定；過氧化氫酶(catalase，CAT)活性采用紫外吸收法測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007對測定的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和制圖，利用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，同時(shí)采用Duncan進(jìn)行多重比較和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ射線輻射對2種露地菊品種葉綠素含量的影響

由圖1可知，與CK相比，在15 Gy處理下，2種露地菊品種的葉綠素含量均顯著降低；25 Gy處理下，東林瑞雪葉綠素含量顯著低于CK和20 Gy，較CK降低了46.71%，而粉翎葉綠素含量隨著輻射劑量的增加呈一定的上升趨勢；35 Gy處理下，2個(gè)品種的葉綠素含量均最低，東林瑞雪和粉翎分別較CK顯著降低了64.11%和37.35%，且東林瑞雪在35 Gy處理下植株出現(xiàn)干枯、死亡的現(xiàn)象，說明東林瑞雪對輻射的敏感性強(qiáng)于粉翎。

注：不同小寫字母表示同一品種不同輻射處理下差異顯著(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters indicate significant difference under different irrigation treatments for the same variety at 0.05 level. The same as following.圖1 不同輻射處理對2種露地菊葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of different radiation treatments on chlorophyll content of two kinds of Chrysanthemum grandiflorum

2.2 60Co-γ射線輻射對2種露地菊品種可溶性蛋白含量的影響

由圖2可知，隨著輻射劑量的增加，2種露地菊品種可溶性蛋白含量均呈逐漸下降的趨勢。與CK相比，15 Gy處理下，東林瑞雪和粉翎的可溶性蛋白含量分別降低了71.30%和35.59%，且差異顯著；35 Gy處理下，東林瑞雪和粉翎可溶性蛋白含量均最低，分別較CK下降了89.24%和85.22%。

圖2 不同輻射處理對2種露地菊可溶性蛋白含量的影響Fig.2 Effect of different radiation treatments on soluble protein content of two kinds of Chrysanthemum grandiflorum

2.3 60Co-γ射線輻射對2種露地菊品種脯氨酸含量的影響

由圖3可知，隨著輻射劑量的增加，2種露地菊品種的脯氨酸含量均呈顯著上升趨勢，且東林瑞雪的增加幅度高于粉翎。15 Gy處理下東林瑞雪和粉翎的脯氨酸含量分別較CK增加了294.69%和79.22%；25 Gy處理下，東林瑞雪和粉翎脯氨酸含量均顯著高于CK；35 Gy 處理下，東林瑞雪和粉翎脯氨酸含量均達(dá)到最大值，分別較CK增加了 1 339.97%和676.57%。

圖3 不同輻射處理對2種露地菊脯氨酸含量的影響Fig.3 Effect of different radiation treatments on proline content of two kinds of Chrysanthemum grandiflorum

2.4 60Co-γ射線輻射對2種露地菊品種MDA含量的影響

由圖4可知，隨著輻射劑量的增加，2種露地菊品種的MDA含量均呈上升趨勢，且變化趨勢基本一致，東林瑞雪MDA含量在各輻射處理下均高于粉翎。30 Gy處理下，東林瑞雪MDA含量較CK顯著增加了106.33%，粉翎增加了85.00%；35 Gy處理下，東林瑞雪和粉翎MDA含量達(dá)到最大值，分別較CK增加了210.84%和185.00%，說明高輻射劑量處理會(huì)加劇露地菊膜脂過氧化，植物此時(shí)所受的傷害程度最大，且東林瑞雪較粉翎膜脂過氧化程度更嚴(yán)重。

圖4 不同輻射處理對2種露地菊MDA含量的影響Fig.4 Effect of different radiation treatments on MDA content of two kinds of Chrysanthemum grandiflorum

2.5 60Co-γ射線輻射對2種露地菊品種SOD活性的影響

由圖5可知，隨著輻射劑量的增加，2種露地菊品種的SOD活性均呈先增加后降低的趨勢，且東林瑞雪SOD活性在各輻射處理下均高于粉翎。15 Gy處理下，東林瑞雪和粉翎SOD活性較CK分別顯著增加了72.48%和10.15%；20 Gy和25 Gy處理下，東林瑞雪SOD活性分別較CK增加了74.17%和127.26%，粉翎SOD活性明顯增加，其中20 Gy處理下與CK差異不顯著，25 Gy處理下與CK差異顯著；30 Gy處理下，東林瑞雪和粉翎的SOD活性均達(dá)到最大值；35 Gy處理下，二者SOD活性均明顯降低，但仍顯著高于CK。

圖5 不同輻射處理對2種露地菊SOD活性的影響Fig.5 Effect of different radiation treatments on SOD activity of two kinds of Chrysanthemum grandiflorum

2.6 60Co-γ射線輻射對2種露地菊品種POD活性的影響

由圖6可知，隨著輻射劑量的增加，2種露地菊品種POD活性均呈上升的趨勢。與CK相比，20 Gy處理下，東林瑞雪POD的活性顯著，而粉翎與CK相比差異不顯著；25 Gy處理下，2種露地菊品種與CK相比均顯著增加；35 Gy處理下，東林瑞雪和粉翎POD活性均達(dá)到最高，與CK相比分別增加了187.32%、86.61%。

圖6 不同輻射處理對2種露地菊葉片POD活性的影響Fig.6 Effect of different radiation treatments on POD activity of two kinds of Chrysanthemum grandiflorum

2.7 60Co-γ射線輻射對2種露地菊品種CAT活性的影響

由圖7可知，隨著輻射劑量的增加，東林瑞雪CAT活性呈先增加后降低的趨勢，15 Gy處理下，CAT活性顯著增加，較CK增加了85.79%；30 Gy處理下，CAT活性最高，較CK增加了465.02%；35 Gy處理下，CAT活性明顯降低。隨著輻射劑量的增加，粉翎CAT活性呈逐漸上升的趨勢，35 Gy處理下，CAT活性最高，較CK增加了179.89%。

圖7 不同輻射處理對2種露地菊CAT活性的影響Fig.7 Effects of different radiation treatments on CAT activity of two kinds of Chrysanthemum grandiflorum

3 討論

葉綠素作為植物進(jìn)行物質(zhì)代謝和能量代謝的基礎(chǔ)物質(zhì)，在一定范圍內(nèi)，其含量與光合速率呈明顯的正相關(guān)關(guān)系[21]。本研究中，隨著輻射劑量的增加，2種露地菊品種的葉綠素含量均呈下降趨勢，且輻射劑量越高，下降越明顯，其原因可能是輻射處理導(dǎo)致2種露地菊的葉綠體結(jié)構(gòu)受到損傷。這與范菁[22]和李瑜等[23]的研究結(jié)果一致。

可溶性蛋白作為植物的滲透調(diào)節(jié)劑，也是高等植物的主要代謝產(chǎn)物之一[24]。研究表明，可溶性蛋白質(zhì)含量的下降是植物衰老的重要指標(biāo)之一[25]。本研究中，2種露地菊品種的可溶性蛋白含量均隨著輻射劑量的增加呈下降趨勢，這與史玉敏等[26]、彭振英等[27]的研究結(jié)果類似，其原因可能是高強(qiáng)度的輻照抑制了相應(yīng)蛋白質(zhì)合成基因的正常表達(dá)。植物主要通過滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵御逆境脅迫，脯氨酸是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的重要組成成分，能提高植物細(xì)胞滲透勢以增加對水分的攝入，同時(shí)還能提升細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，減少植物受到的生理損傷，在植物受到脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用[28]。本研究中，2種露地菊的脯氨酸含量均隨著輻射劑量的增加呈逐漸增加的趨勢，這與章毅等[29]的研究結(jié)果相似，其原因可能是脯氨酸合成酶抑制了脯氨酸反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，導(dǎo)致脯氨酸含量增加。

植物在受到外界環(huán)境脅迫或進(jìn)入衰老階段時(shí)，植物體內(nèi)會(huì)發(fā)生膜質(zhì)過氧化作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的自由基代謝平衡狀態(tài)被打破，產(chǎn)生膜脂過氧化產(chǎn)物MDA，造成植物的一些器官受損傷，因此MDA含量可作為逆境脅迫對植物傷害程度的衡量標(biāo)準(zhǔn)[30-32]。本研究中，2種露地菊品種MDA含量均隨著輻射劑量的增加呈顯著增加趨勢，說明60Co-γ射線輻射處理對露地菊造成了膜質(zhì)過氧化傷害，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧和自由基增加，進(jìn)而破壞了細(xì)胞膜的完整性。這與高桐梅等[33]、李杰等[34]、廖安紅等[35]、葛維亞等[36]的研究結(jié)果一致。

保護(hù)酶活性的高低，可以反映出植物對外界環(huán)境的適應(yīng)性[37]。前人研究表明，低劑量的60Co-γ輻射處理能一定程度促進(jìn)SOD和POD活性的增加，從而增強(qiáng)植物的抗逆性，但當(dāng)輻射劑量過高時(shí)，SOD和POD活性呈下降趨勢[38-40]。本研究中，隨著輻射劑量的增加，2種露地菊品種SOD活性均呈先上升后下降的趨勢；2種露地菊品種POD活性均呈增加的趨勢，其原因可能是低劑量輻射促進(jìn)植物一系列修復(fù)酶的活性，減輕了植物受到的傷害，但隨著輻射劑量的增加，植株體內(nèi)過氧化物及自由基積累量過大，造成SOD活性下降。此外，輻射對植物產(chǎn)生了一定的負(fù)向作用，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的過氧化物增多，從而使POD活性增強(qiáng)，這與李瑜等[23]和滕娟等[32]的研究結(jié)果一致。CAT是一種清除性酶類，可以促使H2O2分解為水和氧分子，從而使植物免受H2O2的毒害[41]。本研究結(jié)果表明，隨著輻射劑量的增加，東林瑞雪CAT活性整體呈先升高后降低的趨勢，而粉翎CAT活性呈增加的趨勢，說明粉翎對輻射的耐受能力強(qiáng)于東林瑞雪。

60Co-γ射線輻射育種研究中，輻射后植物材料生理生化指標(biāo)的變化可作為判斷輻射育種效果的依據(jù)[42]。本研究中，在15～35 Gy劑量范圍內(nèi)，不同輻照處理對2種露地菊葉綠素含量、可溶性蛋白含量、脯氨酸含量、MDA含量，以及SOD、POD、CAT活性的影響不同，說明不同品種露地菊對輻射的敏感性存在差異，輻射后東林瑞雪各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化幅度較大，綜合分析認(rèn)為東林瑞雪對輻射更為敏感。

4 結(jié)論

本研究對經(jīng)60Co-γ射線輻射后2種露地菊品種的生理生化及損傷機(jī)理進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，粉翎對輻射的耐受性較強(qiáng)，而輻射后東林瑞雪各項(xiàng)生理指標(biāo)的變化幅度較大，對輻射更為敏感，因此東林瑞雪可作為輻射育種的材料。此外，生理指標(biāo)的變化與輻射的敏感性存在一定的相關(guān)性，因此可以將輻射后的生理指標(biāo)作為誘變效果的依據(jù)。本研究結(jié)果為深入開展露地菊輻射育種，豐富露地菊種質(zhì)資源，培育優(yōu)質(zhì)的新品種提供了一定的理論依據(jù)和技術(shù)參考。