朱海生 劉建汀 溫文旭 李永平 王 彬 陳敏氡 溫慶放

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所/福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013)

印度南瓜(CucurbitamaximaL．)又名西洋南瓜、日本南瓜、栗南瓜、筍瓜等，為葫蘆科(Cucurbitaceae)南瓜屬(CucurbitaLinn.)一年生草本植物，起源于南美洲，是南瓜屬作物中主要栽培種類之一[1-2]。研究表明，印度南瓜具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，受到了消費者的廣泛青睞，市場需求量較大，栽培面積逐年增加[3-5]。但印度南瓜在我國生產(chǎn)上作為食用蔬菜栽培歷史較短，且育種技術(shù)較落后，嚴(yán)重制約了其產(chǎn)業(yè)發(fā)展。近來年，隨著消費者對印度南瓜的品種和品質(zhì)要求愈來愈高，傳統(tǒng)的育種方法和技術(shù)已不能滿足市場需求[6]，因此運用現(xiàn)代生物技術(shù)對南瓜重要功能基因的表達(dá)分析和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行研究，培育優(yōu)質(zhì)南瓜品種具有重要意義。

實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)是在傳統(tǒng)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展而來的一種新型核酸定量技術(shù)，具有靈敏度高、重復(fù)性好、特異性強(qiáng)、高通量等特點，已被廣泛應(yīng)用于基因的表達(dá)分析[7-9]。研究表明，在應(yīng)用RT-qPCR進(jìn)行基因表達(dá)分析時，為了消除不同材料細(xì)胞間RNA和初始cDNA模板的質(zhì)量和完整性、引物的特異性、PCR擴(kuò)增效率等產(chǎn)生的偏差，需要選擇合適的內(nèi)參基因來校正靶基因的表達(dá)水平，從而減少樣本本身對定量結(jié)果的影響[10-12]。理想的內(nèi)參基因應(yīng)該在任何條件下都能夠穩(wěn)定表達(dá)，目前一般選擇穩(wěn)定表達(dá)的看家基因作為內(nèi)參基因[13]，如18S核糖體RNA(18S ribosomal RNA，18SrRNA)基因、肌動蛋白(actin，ACT)基因、甘油醛-3-磷酸-脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因、泛素蛋白(ubiquitin，UBQ)基因、α-微管蛋白(a-tubulin，TUA)和β-微管蛋白(β-tubulin，TUB)基因等[14-17]。真核生物延伸因子(elongation factor 1 alpha，EF1a)是一種多聚體核糖體蛋白質(zhì)，其有助于肽鏈的延伸，在不同的作物中其基因序列及表達(dá)調(diào)控均高度保守，具有內(nèi)參基因的特征特性，通常作為內(nèi)參基因應(yīng)用于植物基因表達(dá)研究[18-20]。但目前關(guān)于印度南瓜EF1a基因的克隆和作為內(nèi)參基因應(yīng)用的研究尚鮮見報道。本研究獲得了1條印度南瓜內(nèi)參基因EF1a，以該內(nèi)參基因為基礎(chǔ)設(shè)計1對RT-qPCR引物，并評估該基因表達(dá)的穩(wěn)定性，以期為開展印度南瓜重要功能基因的表達(dá)分析及相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

印度南瓜材料由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心提供。采集印度南瓜根、莖、花、幼葉、老葉、幼瓜、老瓜、高溫處理(38℃)葉片、低溫處理(8℃)葉片、干旱處理1 d葉片、干旱處理3 d葉片作為試驗材料，每個樣品均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，樣品采集后立即用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 印度南瓜EF1a基因的開放閱讀框擴(kuò)增

參考Zhu等[21]的方法，根據(jù)印度南瓜RNA-seq數(shù)據(jù)庫，篩選得到1條EF1a基因全長序列。設(shè)計印度南瓜的EF1a基因的開放閱讀框(open reading frame，ORF)擴(kuò)增引物，正向引物F：5′-A T G G G T A A G G A A A A G A T T CA- 3′，反向引物R：5′-T T A T T T C T T C T T C A C T G C G GA- 3′。提取1.1中所有印度南瓜樣品的總RNA，并按照PrimeScriptTM Ⅱ 1stStrand cDNA Synthesis Kit試劑盒[TaKaRa(日本) 公司]的方法將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈。PCR總體積為25 μL：25 ng模板、0.4 μmol·L-1正反向引物各1 μL、0.15 mmol·L-1dNTP 1 μL、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol·L-1MgCl2的10×PCR緩沖液2.5 μL，用滅菌的超純水補(bǔ)足至 25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性 30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環(huán)；72℃終延伸10 min；4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 印度南瓜EF1a基因生物信息學(xué)分析

印度南瓜EF1a基因序列的理化性質(zhì)分析采用EditSeq(版本5.01)軟件；基因引物設(shè)計采用Oligo Analyzer 3.1在線軟件(http://sg.idtdna.com/calc/analyzer)；基因和蛋白序列使用在線分析軟件(http: //www.bio-soft.net/sms/index.html)；同源蛋白多序列比對采用MEGA4.0軟件和Clustal W2軟件；CmEF1a蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析采用SMART在線分析軟件(http: //smart.embl-heidelberg.de/)；CmEF1a蛋白質(zhì)翻譯后修飾采用MotifScan在線軟件(http: //myhits.isb-sib.ch/cgibin/motif_scan)；CmEF1a亞細(xì)胞定位采用Wolf Psort在線軟件(http: //www.genscript.com/psort/wolf_psort.html)；CmEF1a一級結(jié)構(gòu)分析采用ProtScale(http: //web.expasy.org/protscale/)和ProtParam(http: //web.expasy.org/protparam/)在線軟件；CmEF1a二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用PRABI(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_consensus.pl)在線軟件；CmEF1a三級結(jié)構(gòu)建模采用在線軟件SWISS-MODEL(https: //swissmodel.expasy.org/interactive)。

1.4 印度南瓜EF1a基因引物設(shè)計與常規(guī)PCR檢測

利用Premier 3.0 軟件設(shè)計出1對RT-qPCR特異引物，上游EF1：5′-A C G G T G A T G C T G G T A T G G T TA- 3′，下游EF2：5′-C A T T G T T G T T G G T T G G C T T A TT- 3′。PCR反應(yīng)體系總體積為25 μL：25 ng模板、0.4 μmol·L-1正反向引物各1 μL、0.15 mmol·L-1dNTP1 μL、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol·L-1MgCl2的10×PCR緩沖液2.5 μL，用滅菌的超純水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后，回收純化連接到pMD18-T載體上，挑取陽性克隆子測序。

1.5 熒光定量引物PCR檢測

以印度南瓜cDNA第一鏈作為模板，根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒[TaKaRa(日本) 公司]方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為25 μL：12.5 μL Power SYBR?Green PCR Master Mix、1 μL模板、10 μmol·L-1RT-qPCR正反向引物各0.5 μL，用蒸餾水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40個循環(huán)；4℃保存；每個反應(yīng)重復(fù)3次。

1.6 印度南瓜EF1a基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

1.6.1 半定量RT-PCR分析 提取印度南瓜根、莖、花、幼葉、老葉、幼瓜、老瓜、高溫處理(38℃)葉片、低溫處理(8℃)葉片、干旱處理1 d葉片、干旱處理3 d葉片的總RNA，分別反轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，將獲得的cDNA濃度調(diào)整至約50 ng·μL-1，以actin基因為內(nèi)參基因[22]，運用半定量進(jìn)行RT-PCR檢測EF1a基因表達(dá)量，PCR擴(kuò)增體系總體積為25 μL：25 ng模板、0.4 μmol·L-1正反向引物各1 μL、0.15 mmol·L-1dNTP1 μL、1 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol·L-1MgCl2的10×PCR緩沖液2.5 μL，用滅菌的超純水補(bǔ)足至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃終延伸10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物通過1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳并拍照，對PCR條帶進(jìn)行密度掃描分析。

1.6.2 熒光定量引物PCR分析 以1.6.1中的印度南瓜cDNA第一鏈為模板，以actin基因為內(nèi)參基因[21]。根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM熒光定量PCR試劑盒[TakaRa(日本)公司]說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系總體積為25 μL：12.5 μL Power SYBR?Green PCR Master Mix、1 μL模板、10 μmol·L-1RT-qPCR正反向引物各0.5 μL，用蒸餾水補(bǔ)足至總體積25 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40個循環(huán)。每個反應(yīng)均重復(fù)3次，4℃保存。采用2-ΔΔCt法[23]計算目的基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 印度南瓜EF1a基因擴(kuò)增

根據(jù)印度南瓜轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果，篩選得到1條EF1a基因全長，在此基礎(chǔ)上，設(shè)計EF1a基因ORF引物進(jìn)行驗證。由圖1可知，EF1a基因的cDNA全長為1 701 bp，ORF大小為1 344 bp，命名為CmEF1a，(GenBank登錄號：MH310443)。

Note:1：EF1a. M：DL 2 000 marker.圖1 印度南瓜EF1a基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplified product of EF1a gene in pumpkin

2.2 CmEF1a基因生物信息學(xué)分析

2.2.1CmEF1a基因編碼蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)分析 由圖2可知，CmEF1a含有1條長度為1 701 bp的cDNA序列，其編碼區(qū)的GC含量為48.96%，預(yù)測編碼447個氨基酸，理論分子量為49.30 kD，等電點為9.14，pH值為7.0時的帶電荷數(shù)為14.42。在構(gòu)成CmEF1a蛋白的20種氨基酸中，賴氨酸(Lys，K)含量最高，為11.0%，纈氨酸(Vla，Ⅴ)和甘氨酸(Gly，G)次之，分別為8.7%和8.5%，色氨酸(Trp，W)含量最低為0.7%。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，CmEF1a蛋白質(zhì)包含67個疏水氨基酸、54個極性氨基酸、14個堿性氨基酸和95個酸性氨基酸。CmEF1a蛋白質(zhì)的總平均疏水性(GRAVY)為-0.305，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為31.96，脂肪族指數(shù)為83.91，預(yù)測其為親水性蛋白質(zhì)。

2.2.2 CmEF1a蛋白質(zhì)翻譯后修飾、結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位分析 Motif Scan在線軟件分析顯示，CmEF1a基因編碼的蛋白質(zhì)包含有1個保守的EF1結(jié)構(gòu)域(2～432位，E值為9e-45)和EF1的C端保守結(jié)構(gòu)域(322～430位，E值為7.7e-60)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，327～330位為N-糖基化位點；14～21位為ATP/GTP結(jié)合位點；88～91、107～110、194～197、206～209、215～218、286～289、317～320和371～374位為酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點；105～110、121～126、245～250、263～268、339～344、424～429和436～441位為豆蔻?；稽c；18～20、53～55、82～84、159～161、230～232和371～373位為蛋白激酶C磷酸化位點。此外，WoLF PSORT在線預(yù)測分析表明，CmEF1a定位于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中。

2.2.3 CmEF1a蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)分析 由圖3可知，CmEF1a蛋白無規(guī)則卷曲所占比例為48.77%、延伸鏈所占比例為22.37%、α-螺旋所占比例為28.86%，表明無規(guī)則卷曲為該蛋白質(zhì)的主要二級結(jié)構(gòu)，且CmEF1a蛋白與中國南瓜、甜瓜和黃瓜的EF1a同源蛋白的三級空間高度相似。

2.2.4 CmEF1a蛋白質(zhì)的同源比對和進(jìn)化分析 將印度南瓜CmEF1a基因編碼的蛋白質(zhì)與其他植物EF1a同源性比對。由圖4可知，印度南瓜CmEF1a與其他植物EF1a氨基酸具有較高同源性，其中與中國南瓜(Cucurbitamoschata，XP_022959419.1)、黃瓜(Cucumissativus，XP_004138964.1)、甜瓜(Cucumismelo，XP_008457229.1)、苦瓜(Momordicacharantia，XP_022138472.1)、葡萄(Vitisvinifera，XP_002284964.1)氨基酸序列編碼的同源蛋白質(zhì)相似性分別為99%、99%、99%、98%和98%。

為進(jìn)一步明確印度南瓜CmEF1a的功能與進(jìn)化關(guān)系，將CmEF1a的蛋白序列與NCBI中的蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，并從中下載了其他物種的15個EF1a同源蛋白。由圖5可知，印度南瓜CmEF1a與葫蘆科的中國南瓜、甜瓜、黃瓜和苦瓜EF1a的親緣關(guān)系最為接近，暗示其具有相似或者相近的功能，與菠蘿、鐵皮石斛和丹參EF1a的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 CmEF1a基因全長序列及氨基酸序列Fig.2 Full sequence and amino acid sequence of CmEF1a gene

注：A:印度南瓜;B:中國南瓜;C:甜瓜;D:黃瓜。Note:A:Cucurbita maxima.B:Cucurbita moschata.C:Cucumis melo.D:Cucumis sativus.圖3 CmEF1a及其同源蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig.3 Prediction of tertiary structure of CmEF1a and it′s homologous protein

注：XP_022959419. 1: 中國南瓜; XP_008457229. 1: 甜瓜; XP_004138964. 1: 黃瓜; XP_022138472. 1: 苦瓜;XP_002284964.1:葡萄; CmEF1a:印度南瓜。Note: XP_022959419.1: Cucurbita moschata. XP_008457229.1: Cucumis melo. XP_004138964.1: Cucumis sativus.XP_022138472.1: Momordica charantia. XP_002284964.1: Vitis vinifera. CmEF1a: Cucurbita maxima.圖4 CmEF1a與其他物種同源蛋白質(zhì)的多重比對Fig.4 Multiple alignment of CmEF1a with other homologous proteins

2.3 CmEF1a基因引物設(shè)計及常規(guī)PCR檢測

以印度南瓜葉片cDNA第一鏈為模板，利用熒光定量PCR特異引物對EF1和EF2進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖6可知，經(jīng)1%凝膠電泳檢測，得到1條明亮的單一條帶，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增條帶，經(jīng)測序其大小為211 bp，與RNA-Seq數(shù)據(jù)庫中篩選得到的印度南瓜內(nèi)參基因CmEF1a(GenBank登錄號：MH310443)的同源性為100%。

注：M：DL 2 000 marker；1：引物EF1/EF2擴(kuò)增片段。Note:M: DL 2 000 marker. 1: Fragment of primer EF1/EF2 amplification.圖6 引物EF1/EF2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.6 PCR amplified product of primer EF1/EF2

2.4 CmEF1a基因熒光定量PCR引物檢測

以印度南瓜葉片cDNA第一鏈作為模板，利用熒光定量特異引物對EF1和EF2進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。結(jié)果表明，3次重復(fù)的RT-qPCR擴(kuò)增曲線均較好(圖7)。為檢驗反應(yīng)的特異性，在RT-qPCR反應(yīng)后分析溶解曲線(圖8)，3次重復(fù)平均溶解溫度(Tm)為82.86℃，均僅有一個特異峰，表明沒有引物二聚體，未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增特異性強(qiáng)，即所設(shè)計的1對RT-qPCR引物特異性強(qiáng)、重復(fù)性高，可作為內(nèi)參引物用于印度南瓜熒光定量PCR。

圖7 引物EF1/EF2擴(kuò)增曲線Fig.7 The amplification curves of primer EF1/EF2

圖8 引物EF1/EF2溶解曲線Fig.8 The melting curves of primer EF1/EF2

2.5 CmEF1a基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

以印度南瓜根、莖、花、幼葉、老葉、幼瓜、老瓜、高溫處理(38℃)、低溫處理(8℃)、干旱處理1 d、干旱處理3 d的cDNA第一鏈為模板，分別利用RT-PCR技術(shù)和RT-qPCR技術(shù)分析印度南瓜CmEF1a基因的表達(dá)情況。半定量RT-PCR檢測結(jié)果(圖9)和RT-qPCR檢測結(jié)果(圖10)表明，不同組織和不同脅迫處理下CmEF1a基因表達(dá)量均不存在差異，表明CmEF1a基因在印度南瓜不同組織及不同脅迫處理下均能穩(wěn)定表達(dá)，CmEF1a適合作為印度南瓜基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因。

注：M：DL 2 000 marker；1：根；2：莖；3：花；4：幼葉；5：老葉；6：幼瓜；7：老瓜；8：高溫處理(38℃)葉片；9：低溫處理(8℃)葉片；10：干旱處理1 d葉片；11：干旱處理3 d葉片。Note:M: DL 2 000 marker. 1: Root. 2: Stem. 3: Flower. 4: Young leaf. 5: Old leaf. 6: Young melon. 7: Old melon. 8: High temperature(38℃) treatment leaf. 9: Low temperature (8℃) treatment leaf. 10: Drought treatment(1 day) leaf. 11: Drought treatment(3 day) leaf.圖9 半定量RT-PCR分析CmEF1a基因表達(dá)穩(wěn)定性Fig.9 Semi-quantitative RT-PCR analysis of CmEF1a gene expression stability

注：1：根；2：莖；3：花；4：幼葉；5：老葉；6：幼瓜；7：老瓜；8：高溫處理(38℃)葉片；9：低溫處理(8℃)葉片；10：干旱處理1 d葉片；11：干旱處理3 d葉片。Note:1: Root. 2: Stem. 3: Flower. 4: Young leaf. 5: Old leaf. 6: Young melon. 7: Old melon. 8: High temperature treatment (38℃) leaf. 9: Low temperature (8℃) leaf. 10: Drought treatment(1 day) leaf. 11: Drought treatment(3 day) leaf.圖10 RT-qPCR分析CmEF1a基因表達(dá)穩(wěn)定性Fig.10 RT-qPCR analysis of CmEF1a gene expression stability

3 討論

利用RT-qPCR進(jìn)行基因表達(dá)分析是闡明植物基因功能和調(diào)控機(jī)制的重要手段。選擇適宜不同作物的內(nèi)參基因是提高RT-qPCR準(zhǔn)確性的重要條件[24]。大量研究表明，EF1a基因具有高度保守、表達(dá)穩(wěn)定等特點，已被廣泛用于不同作物研究的內(nèi)參基因。香樟CcEF1a基因在低溫脅迫下的葉片中表達(dá)量穩(wěn)定，可以在RT-qPCR 分析中作為內(nèi)參基因[25]。Nicot等[26]分析了7個傳統(tǒng)內(nèi)參基因在馬鈴薯生物脅迫(晚疫病)和逆境脅迫(鹽、干旱) 條件下的表達(dá)穩(wěn)定性，結(jié)果表明EF1a的穩(wěn)定性最好。李錢峰等[27]以6個秈粳稻品種胚乳為研究材料，通過geNorm分析表明，不同的品種間eEFla和ACT1 的表達(dá)最穩(wěn)定。EF1a基因序列、氨基酸序列及表達(dá)調(diào)控在真核生物中高度保守[28]。本研究獲得了1條印度南瓜CmEF1a基因，其編碼EF1a的蛋白與中國南瓜(Cucurbitamoschata，XP_022959419.1)、黃瓜(Cucumissativus，XP_004138964.1)和甜瓜(Cucumismelo，XP_008457229.1)的同源蛋白相似性極高，均達(dá)到99%。EF1a基因在分子進(jìn)化水平上也較為保守，印度南瓜CmEF1a蛋白保守結(jié)構(gòu)域2～432位為1個EF1結(jié)構(gòu)域，322～430位為EF1的C端保守結(jié)構(gòu)域，顯示出EF1a家族蛋白進(jìn)化的高度保守性。EF1a 蛋白的高保守性表明，EF1a基因?qū)Ω鱾€物種有著相當(dāng)重要的意義并發(fā)揮相似的作用[25]。印度南瓜CmEF1a基因的獲得豐富了印度南瓜內(nèi)參基因的選擇，為研究印度南瓜基因表達(dá)提供了更多的參考序列。

內(nèi)參基因穩(wěn)定性至關(guān)重要[29-30]。理想的內(nèi)參基因應(yīng)在所有的植物細(xì)胞中或各種生理狀態(tài)下都能夠穩(wěn)定表達(dá)。但實際上，基因的表達(dá)在植物不同組織、不同生長發(fā)育過程、不同脅迫條件下都會發(fā)生改變，內(nèi)參基因的穩(wěn)定表達(dá)是相對的[31-33]。根據(jù)不同植物試驗材料及條件，篩選合適的內(nèi)參基因才能保障目標(biāo)基因表達(dá)定量的準(zhǔn)確性及可靠性[34]。真核生物延伸因子EF1a廣泛存在真核生物體內(nèi)，是真核生物體內(nèi)第二多的蛋白，在進(jìn)化過程中具有保守性[35]。大量研究表明，EF1a基因是矮牽牛[36]、鐵皮石斛[37]、黃瓜[38]大白菜[39]和荷花[40]等植物中最穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。本研究基于獲得的印度南瓜CmEF1a基因全長cDNA序列，設(shè)計了1對印度南瓜CmEF1a基因RT-qPCR引物，PCR擴(kuò)增得到211 bp大小DNA片段。通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，該對引物的擴(kuò)增曲線重復(fù)性高，且溶解曲線僅有單一峰，具有較高的特異性和重復(fù)性，符合作為RT-qPCR引物的基本條件。半定量RT-PCR和RT-qPCR結(jié)果表明，CmEF1a基因在印度南瓜不同組織和不同脅迫處理下都能穩(wěn)定表達(dá)，適合作為內(nèi)參基因應(yīng)用于印度南瓜基因表達(dá)研究。在基因表達(dá)分析中，同時使用2個或多個內(nèi)參基因可大幅度降低系統(tǒng)偏差，從而有助于獲得更準(zhǔn)確的基因定量表達(dá)數(shù)據(jù)。針對目前印度南瓜中內(nèi)參基因研究較少的現(xiàn)狀，今后可基于印度南瓜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，繼續(xù)挖掘印度南瓜其他內(nèi)參基因，如GAPDH、NADHD、18srRNA、UBI等，進(jìn)一步提高印度南瓜基因表達(dá)分析研究的穩(wěn)定性、重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

本研究首次獲得了印度南瓜CmEF1a基因，并根據(jù)CmEF1a序列特征設(shè)計了1對RT-qPCR引物。該引物特異性強(qiáng)，無非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)，擴(kuò)增效率高，在印度南瓜不同組織和不同脅迫處理下均能穩(wěn)定表達(dá),適合作為內(nèi)參基因應(yīng)用于印度南瓜的基因表達(dá)研究。這為今后開展印度南瓜重要功能基因的表達(dá)分析及相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制的研究提供了一定的理論依據(jù)。