宋恭帥 張蒙娜 馬永鈞 周小敏 崔益瑋 戴志遠,3 沈 清,3,*

(1 浙江工商大學海洋食品研究院，浙江 杭州 310012； 2 浙江興業(yè)集團有限公司，浙江 舟山 316101； 3浙江省水產(chǎn)品加工技術研究聯(lián)合重點實驗室，浙江 杭州 310012)

由于海況的變化和海上捕撈強度的不斷增加，沿岸和近海漁業(yè)資源的結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大變化。傳統(tǒng)海產(chǎn)資源不斷衰退，而金槍魚等遠洋漁獲物品種的產(chǎn)量穩(wěn)定上升。近幾年世界金槍魚年產(chǎn)量穩(wěn)定在400萬t左右，產(chǎn)值達300多億美元[1]，金槍魚已成為我國海產(chǎn)品中加工出口的主要品種[2]。但由于缺乏先進的高值化加工技術，在金槍魚等海洋生物資源加工處理過程中，可利用部分僅占50%～70%，金槍魚眼窩、內(nèi)臟等加工廢棄物得不到較好的利用，大部分被當作飼料或直接丟棄[3]。這些廢棄物中含有大量的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等生物活性物質(zhì)，在食品、化工、保健品和化妝品等領域均有較大需求[4]。海洋生物加工廢棄物的綜合利用是現(xiàn)代食品加工的突出任務之一。近年來對海洋生物資源加工廢棄物綜合利用的研究越來越多，并取得了很多進展，但整體應用水平尚未得到顯著提高[5-6]。

隨著人們對魚油的營養(yǎng)及保健功能的認可，魚油提取開發(fā)成為水產(chǎn)品資源綜合利用的熱點之一。魚類內(nèi)臟廢棄物中富含人體所必需的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFA)，尤其是金槍魚，其內(nèi)臟中含有豐富的二十碳五烯酸(eicosapentenoic acid，EPA)、二十二碳六烯酸(docasahexenoic acid，DHA)、亞油酸及花生四烯酸等[7-8]。研究表明，EPA和DHA為水產(chǎn)生物所特有的脂肪酸組分，具有降低炎癥反應、降低血脂、預防心臟血管疾病等生理保健功能，但二者生物和醫(yī)學功能有較大差別，DHA主要對腦神經(jīng)生產(chǎn)發(fā)育至關重要，而EPA具有降低人體中膽固醇和甘油三酯的含量、促進體內(nèi)飽和脂肪酸代謝的作用，且高純度乙基EPA能有效治療精神性和神經(jīng)性疾病[9]。PUFA的富集純化主要是通過尿素包合、分子蒸餾、銀離子絡合及高效液相色譜等方法實現(xiàn)的。林文等[10]采用尿素包合法聯(lián)合分子蒸餾技術提純乙酯型魚油中的EPA和DHA，其純度高達78.90%，回收率為49.00%。張良等[11]以蛇鯔魚油為原料，利用硝酸銀硅膠柱色譜分離純化EPA和DHA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EPA和DHA的質(zhì)量分數(shù)分別從4.43%、13.94%提高至21.47%、70.13%，總質(zhì)量分數(shù)可達90.00%以上。目前，從魚類加工廢棄物中提取魚油的方法研究較多，王芳[12]采用復合蛋白酶水解法提取粗魚油，其提取率可達85.67%，且Ω-3系列PUFA含量較高；Sahena等[13]通過超臨界流體萃取法從魚內(nèi)臟中提取魚油，其PUFA含量在56.00%以上，且EPA和DHA含量分別為9.00%和10.00%。此外，微波提取油脂技術作為新型的提取方法也被廣泛應用于各種油脂的提取[14]，而傳統(tǒng)的提取方法如蒸煮法，其提取率一般較低，品質(zhì)相對較差[15]。

本試驗以金槍魚加工廢棄物為原料，通過響應面法優(yōu)化酶輔助提取粗魚油的工藝條件，通過粗魚油精制、化學催化乙酯化、多級分子蒸餾和尿素包合初步純化、精餾高純化，以及合成銀離子功能材料螯合制備分離等一系列技術手段，制備高含量乙酯型EPA魚油，以期為魚類加工副產(chǎn)物的高值化利用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚內(nèi)臟、眼窩等副產(chǎn)物購自浙江興業(yè)集團有限公司；脂肪酸乙酯混合標準品購自杭州邦沃森生物科技有限公司；胰蛋白酶(60 000 U·g-1)，北京Solarbio公司；甲醇(色譜純)，德國Merck公司；硅膠(300～400目)，國藥集團化學試劑有限公司；巰丙基三甲氧基硅烷偶聯(lián)劑(MPTS)和正丁胺(分析純)，中國西隴化工股份有限公司；超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)，Milli-Q純水系統(tǒng)制得；所有提取用有機溶劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設備

RL-60B渦旋混勻器，北京金紫光公司；AL204電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮公司；7890A氣相色譜儀，美國Agilent公司；Rotina 420R落地式高速冷凍離心機，美國Thermo公司；Direct Q8超純水系統(tǒng)，法國Milli-Q公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 粗魚油的提取、精制與乙酯化 金槍魚副產(chǎn)物組織搗碎后加水調(diào)節(jié)料液比至1∶5(w/v)，并調(diào)節(jié)pH值至8.0，再向其加入2%胰蛋白酶，在45℃條件下酶解反應3 h。待反應結(jié)束后，在6 000 r·min-1條件下離心15 min，得到上層魚油，即粗魚油。

粗魚油精制過程參照Crexi等[16]的方法。脫膠工藝參數(shù)：溫度80℃，時間30 min，脫膠劑(85%磷酸)添加量為油重1%，磁力攪拌轉(zhuǎn)速500 r·min-1，待反應結(jié)束，10 000 r·min-1離心10 min；堿法脫酸工藝參數(shù)：溫度40℃，時間20 min，堿液(20% NaOH)添加量與脫膠油的酸價(acid value, AV)有關(理論添加量W理論值=7.13×10-4×W脫膠油×AV；W超量堿=4%×W脫膠油；W總添加量=W理論值+W超量堿)，轉(zhuǎn)速500 r·min-1，待反應結(jié)束，10 000 r·min-1離心10 min，再加入95℃熱水洗滌，每次用量約占油重10%，水洗至中性；吸附脫色工藝參數(shù)：溫度70℃，時間20 min，活性白土添加量占油重10%，轉(zhuǎn)速500 r·min-1，待反應結(jié)束，10 000 r·min-1離心10 min；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)脫臭工藝參數(shù)：溫度220℃，時間60 min，壓力0.06 MPa，轉(zhuǎn)速70 r·min-1。

將200 g精制魚油置于裝有磁力攪拌、冷凝回流和溫度計的三頸燒瓶中，水浴加熱至70℃，并配制100 mL 2 mol·L-1的NaOH/MeOH溶液與粗魚油混合后振蕩搖勻。待皂化完全并冷卻至室溫后，將溶液移至分液漏斗，靜置分層，回收上層油相，并旋蒸除去多余乙醇，最后用80℃的飽和NaCl洗滌，直至下層洗滌液清澈透明，取上相在真空條件下脫水，即得到乙酯型魚油。

1.3.2 分子蒸餾和尿素包合 稱取200 g魚油乙酯加到分子蒸餾設備的進料器，設置預脫氣溫度60℃、蒸餾刮板轉(zhuǎn)速250 r·min-1、冷卻溫度5℃，然后將一級蒸餾得到的物料重新加入進料器，在不同的蒸餾壓力、溫度、蒸餾級數(shù)條件下進行蒸餾分離。將尿素溶于95%乙醇中，65℃水浴攪拌至混合溶液澄清，再加入一定量魚油(魚油∶尿素=3∶2，w/w)，反應0.5 h后停止加熱，低溫靜置一段時間后真空抽濾，濾液通過旋蒸去除，水洗魚油2～3次，真空脫水，即得到純化魚油。

1.3.3 精餾處理 稱取500 mL魚油加入塔釜中，打開低溫恒溫槽和真空泵，檢查系統(tǒng)氣密性后將塔釜加熱至150℃。待塔頂出現(xiàn)回流時，記錄塔釜溫度、真空度等參數(shù)，維持全回流并保持系統(tǒng)穩(wěn)定。打開回流比控制器，收集餾出物。當蒸汽量減少時適當提高塔釜溫度，當物料過少時停止加熱，泄真空，清洗并關閉系統(tǒng)。

1.3.4 銀離子材料螯合 稱取100 g活化硅膠(300～400目)于沸水中活化24 h，干燥后置于盛有1 000 mL鄰二甲苯的錐形瓶中，經(jīng)充分攪拌后加入50 mL巰丙基三甲氧基硅烷偶聯(lián)劑與5 mL正丁胺。搭建加熱冷凝回流裝置，將其于氮氣保護下加熱至150℃并反應24 h，反應結(jié)束后冷卻、靜置、過濾得到巰丙基硅膠，分別用1 L甲苯、丙酮、超純水及甲醇洗滌2次，并于干燥箱內(nèi)60℃干燥16 h，合成巰丙基硅膠。稱取25 g硝酸銀攪拌溶解于1 000 mL甲醇水溶液(1∶1, v/v)，并向其加入100 g巰丙基硅膠，避光攪拌反應2 h，靜置沉降后去除下層沉淀，分別用2 L甲醇和超純水洗滌2次，置于干燥箱內(nèi)60℃干燥16 h，即得到銀硫醇硅膠[17]。

所以如今在陶瓷藝術對公共空間的介入，不僅僅傳承了古代中國文化中的儀式感和宜物精神。更是在豐富人們的視覺，提高人們的審美情趣的同時，為公共空間的動線起到引導的作用，并且為人們提供一個相遇的契機和互動的機會。

將玻璃層析柱(200 mm×30 mm)垂直固定于鐵架臺，將固定相與正己烷混懸液(1∶4，w/w)快速倒入柱內(nèi)，半開底部活塞使流動相緩慢流出；輕敲柱體使固定相沉積緊密，并在固定相頂部覆蓋少量石英砂。稱取1 g脂肪酸乙酯溶解于1 mL正己烷中，關閉活塞并將樣品緩慢加入石英砂表面，然后打開底部活塞使流動相流出，待樣品完全進入石英砂床層后，在層析柱頂部加一個恒壓漏斗，漏斗內(nèi)加入0.5%丙酮-正己烷流動相，控制流動相的流出速度約為1～1.2 mL·min-1進行洗脫。每50 mL洗脫液收集1次，色譜檢測EPA乙酯純度。

1.3.5 氣相色譜條件 檢測條件：HP-88氰丙基色譜柱 (30 m × 0.25 mm, 0.20 μm)；載氣H2；不分流進樣；進樣量1 μL；檢測溫度220℃。程序升溫：起始柱溫設定為70℃，以15℃·min-1升至120℃，保持1 min，再以5℃·min-1升至175℃，保持10 min；最后以5℃·min-1升至220℃，保持5 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

魚油粗提取試驗中所得的5組平行數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2018進行標準差分析，并用Origin 8.0軟件作圖。氣相色譜分析中均使用歸一化法進行定量分析。根據(jù)下式計算得率：

(1)

(2)

式中，m1為粗魚油質(zhì)量；mbp為副產(chǎn)物質(zhì)量；m2為純化產(chǎn)物質(zhì)量；C1為產(chǎn)品中EPA濃度；m3為原料魚油質(zhì)量；C2為原料魚油中EPA濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 粗魚油的提取

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters indicate significant difference at 0.05 level.圖1 各因素對金槍魚魚油提取率的影響Fig.1 Effect of different parameters on the yield of fish oil

2.1.1 單因素試驗結(jié)果 酶解法條件溫和，易于控制，有利于保護魚油的功能性成分，且提取率高，適用于提取大目金槍魚魚油[18]。由圖1-A可知，隨著酶解pH值的升高，大目金槍魚副產(chǎn)物魚油提取率隨之提高，當pH值為8.5時魚油提取率達到峰值，隨后呈現(xiàn)下降的趨勢。催化酶通常具有最適pH值范圍，過酸或過堿條件均會導致酶活力下降或不可逆失活。本試驗根據(jù)胰酶的最適pH值范圍進一步優(yōu)化，確定最佳催化反應pH值為8.5。由圖1-B可知，隨著酶解溫度的升高，魚油提取率顯著上升，當酶解溫度大于40℃時，魚油提取率變化趨勢趨于平緩，并于45℃達到最高值，繼續(xù)升高溫度，魚油提取率顯著下降，表明溫度對酶活性的影響較為直接，升高溫度可加速分子熱運動，促進酶解反應，但當溫度過高時易導致酶結(jié)構(gòu)變性失活。因此，最佳的酶解溫度為45℃。由圖1-C可知，隨著酶解時間的延長，金槍魚油提取率逐步上升，當酶解時間超過3 h后魚油提取率變化趨于平緩，繼續(xù)延長酶解時間對魚油提取率的影響不大，且未出現(xiàn)部分文獻報道的因時間過長導致的魚油被氧化分解的現(xiàn)象[19]。酶解時間過短會導致酶和底物反應不充分，過長則造成浪費，因此以3 h為最佳酶解時間。

根據(jù)上述優(yōu)化得到的條件，在45℃、pH值8.5條件下酶解反應3 h，得到的金槍魚粗魚油提取率為43.56%，這與前人結(jié)果相一致[20]。

2.1.2 響應面試驗設計與分析 在單因素試驗結(jié)果的基礎上，根據(jù)Box-Benhnken設計原理，以酶解pH值(A)、酶解溫度(B)、酶解時間(C)為自變量，魚油提取率(Y)為響應值，響應面試驗因素與水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素水平表Table 1 Design and factors of response surface methodology

表2 響應面方案設計與結(jié)果Table 2 RSM program design and the result

響應面優(yōu)化試驗結(jié)果見表2。利用Design Expert 8.0軟件對表2中的試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析及擬合，得到的魚油提取率回歸方程為：

Y=4.53-0.014A-0.026B+0.37C+0.005AB+0.002 5AC+0.028BC-0.15A2-0.11B2-0.19C2。

由表3可知，模型極顯著(P<0.001)，失擬項不顯著(P> 0.05)，且R2=0.995 5，表明該回歸方程與實際數(shù)據(jù)擬合度較高。本試驗的變異系數(shù)較低，僅為6.62%。變異系數(shù)越低，試驗的穩(wěn)定性越高，說明該方程的可信度較高。響應面分析可知，一次項B具有顯著性(P<0.05)，一次項C及二次項A2、B2、C2具有極顯著性(P<0.001)。

經(jīng)響應面試驗優(yōu)化得出的最佳提取條件為：酶解pH值8.48、酶解溫度45.00℃、酶解時間3.48 h，此條件下提取率預測值為43.87%。由圖2可知，酶解時間超過3 h后對金槍魚魚油提取率的影響較小，為便于實際操作，將酶解條件調(diào)整為：酶解pH值8.5、酶解溫度45℃、酶解時間3 h，在該條件下進行5次重復試驗，驗證得到粗魚油的實際提取率平均值為43.69%±0.61%，與預測值相差不大，表明此優(yōu)化條件有效。

2.2 魚油純化

將提取制備的粗魚油按照1.3.1中的方法處理，得到乙酯型魚油，再通過多級分子蒸餾法和尿素包合法純化魚油，最后用氣相色譜法對提取所得的精制魚油和純化魚油樣品進行脂肪酸乙酯化試驗，將試驗得出的樣品中化學成分的氣相色譜圖和混和標準品氣相色譜圖進行對比，用面積歸一化法定量分析各類脂肪酸的相對含量[21]。結(jié)果顯示，金槍魚油中共檢出19種脂肪酸乙酯分子，以精制魚油為例(圖3)，各個脂肪酸乙酯色譜峰分離度較高，其中信號響應最強的為EPA和DHA，保留時間分別為19.24、23.05 min。

由表4可知，精制魚油中飽和脂肪酸(saturated fatty acids，SFA)、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFA)和PUFA含量較為相近，其中SFA占30.09%，SFA中主要以C16：0為主，其次為C18：0和C14：0；MUFA含量為36.15%，以C18：1和C16：1居多，分別為23.45%和8.25%；不同于普通淡水魚油脂，金槍魚油中PUFA含量較高，達到了33.76%，主要成分為EPA(6.73%)和DHA(21.54%)。通過分子蒸餾處理，C14：0、C16：0等完全脫除，SFA進一步降低到1.25%，MUFA含量也有所下降，降至11.09%，而PUFA則提高至87.66%，其中包括EPA(46.34%)和DHA(34.58%)。經(jīng)尿素包合反應后，SFA降低至11.33%，而PUFA提高至66.99%。

表3 回歸方程參數(shù)方差分析表Table 3 Regression equation parameter analysis of variance table

注:*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.001)。

Note:*indicates significant differences at 0.05 level.**indicates significant differences at 0.001 level.

圖2 魚油提取率的響應面及等高線Fig.2 Response surface plot and contour lines of the fish oil yield

表4 精制和分子蒸餾、尿素包合處理后魚油的脂肪酸組成分析Table 4 The fatty acid ethyl esters of refined fish oil and the fish oil processed by molecular distillation and urea complexation

注: ND表示未檢出。

Note: ND indicates not detected.

2.3 精餾試驗結(jié)果

精餾原料魚油中EPA含量為46.34%(表4)，上樣量為200 g。當精餾塔頂溫度為130℃左右時開始出現(xiàn)回流，全回流1 h后開始收集餾分，每隔1 h對餾分進行氣相色譜分析。由于原料魚油中本身EPA含量已經(jīng)較高，因此初期餾分中的EPA≥60%。隨著試驗的進行，餾分中的EPA含量逐漸升高，2 h后即達到80%以上，4 h左右達到峰值85.3%。精餾后期階段，塔頂EPA含量開始下降，泄真空并停止精餾。將EPA含量≥80%的餾分合并，得到含量為82.40%的高EPA乙酯型魚油46.70g，得率為39.00%。

本試驗比較了不同高度精餾柱(350、500、800 mm)對試驗結(jié)果的影響，發(fā)現(xiàn)當采用350 mm的精餾柱時，由于塔板數(shù)相對較少，產(chǎn)物中EPA含量為僅為76.40%，得率為43.50%。隨著精餾柱高度的增加，產(chǎn)品EPA含量增加，得率降低。當填料高度為800 mm，塔釜溫度升高至200℃以上時也未見塔頂組分餾出，原因可能是精餾柱過高導致壓降過大，同時自制的精餾設備保溫效果并不十分理想，若進一步升高塔釜溫度，極易導致脂肪酸乙酯的聚合、異構(gòu)化等熱敏反應[22]。因此，本試驗選取500 mm的精餾柱用于魚油精餾純化。

2.4 EPA的純化

流動相為經(jīng)精餾加工后EPA純度為82.40%的乙酯型魚油，以1 mL·min-1的流速通過銀硫醇硅膠柱進行洗脫，餾分收集器設置為每管50 mL。每組餾分經(jīng)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后使用氣相色譜檢測EPA純度。由圖4可知，前3 h中EPA未被洗脫，餾分中未能檢測出EPA信號，隨著進一步洗脫，逐漸有EPA流出，7 h時EPA純度即達到了85.70%，8 h時EPA純度為91.00%，并隨著試驗的進行逐步提高，19 h時達到峰值96.30%后呈逐漸下降趨勢。鑒于目前美國阿瑪林公司的Vascepa產(chǎn)品中EPA ≥ 96.00%[23]，將收集的11～19 h的餾分混合后得到純度為96.30%的EPA乙酯，得率為32.90%。

3 討論

圖3 精制魚油氣相色譜圖Fig.3 The gas chromatogram of purified fish oil

圖4 銀離子功能材料螯合制備分離EPA乙酯Fig.4 Silver ion functionalized material for preparative separation of EPA

目前，水產(chǎn)品加工廢棄物中油脂的提取方法有很多種，如蒸煮法、溶劑法、酶解法等。其中，蒸煮法[24]屬物理方法，是利用油脂與水互不相容的原理。在蒸煮條件下，使細胞破裂，并以水作為溶劑，達到分離油脂的目的，此法操作簡單，對試驗設備要求低，但油脂的提取率和品質(zhì)不高。溶劑法多以正己烷、乙醚、異丙醇、石油醚等作為溶劑以提取油脂，但乙醚、石油醚極易揮發(fā)、易爆、易燃，存在一定的安全隱患和環(huán)境污染問題[25]。而酶解法因其操作條件溫和、酶解液可被進一步利用等優(yōu)點被稱為提取動物油脂的理想方法，其作用原理是通過蛋白酶酶解蛋白質(zhì)以破壞其與油脂的結(jié)合，從而得到油脂[26-27]。本試驗通過響應面法優(yōu)化得到酶解法最佳工藝參數(shù)，該條件下魚油提取率為47%，而陶寧萍等[28]報道的酶解法提取黃鰭金槍魚眼窩肉魚油的提取率僅為20.68%，且需在50℃條件下酶解4 h。相比之下，本試驗采用的酶解方法提取率更高、操作時間更短、能耗更省，且EPA與DHA含量高。

本研究采用分子蒸餾法和尿素包合法制備高純度乙酯型金槍魚油，其結(jié)果與傅紅等[29]、張蒙娜等[8]的研究結(jié)果相一致，這兩種富集方法制得魚油中PUFA含量差異較明顯，其主要原因是分子蒸餾能利用物質(zhì)分子間平均自由程的不同而實現(xiàn)組分分離，而魚油中的PUFA與SFA、MUFA間的分子平均自由程相差較大，故能極大提高富集率[30]。而尿素包合法無法將PUFA完全包合，易混入其他組分，無法分離EPA和DHA，且在操作過程中需消耗大量乙醇，并存在乙醇回收率低、環(huán)境污染等潛在問題。在實際生產(chǎn)過程中，尿素包合法常用于魚油富集工藝的預處理[31]。

隨著保健品行業(yè)與魚油制品加工技術的不斷發(fā)展，對EPA乙酯純度的要求越來越高，而純度越高，對加工生產(chǎn)技術要求也就越高。目前，已報到的關于EPA乙酯純度大多數(shù)約為95.00%[31]。本研究采用銀硫醇硅膠柱制備得到的EPA純度高達96.30%。但本研究中魚油純化、精餾及EPA純化等工藝參數(shù)主要是參照相關文獻，未進行優(yōu)化試驗，可能會使試驗結(jié)果有所差異。今后應進行系統(tǒng)的工藝參數(shù)優(yōu)化試驗，進一步完善魚油分離制備及EPA分離純化工藝。

4 結(jié)論

以大目金槍魚副產(chǎn)物為原料，通過響應面優(yōu)化酶輔助提取粗魚油，得到最佳工藝參數(shù)為：酶解pH值8.5、酶解溫度45℃、酶解時間3 h，此條件下粗魚油提取率高達43.69%。采用化學催化乙酯化、多級分子蒸餾和尿素包合初步純化、精餾高純化，以及合成銀離子功能材料螯合制備分離等一系列精制加工技術可制備純化出EPA和DHA含量80.00%以上的魚油，獲得的EPA純度高達96.00%以上，達到了美國FDA注冊認證藥物的含量要求(≥ 96.00%)。本試驗方法可有效用于提取大目金槍魚副產(chǎn)物中的魚油成分。