梁志樂 尚珂含 王立輝 周 瑾 王廣龍,* 熊愛生

(1 淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003；2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095)

鹽脅迫是限制作物生長發(fā)育，影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重要環(huán)境因子之一[1]。在長期的進(jìn)化過程中，植物逐漸形成了一系列的抗逆機(jī)制，其中，谷胱甘肽途徑在此過程中發(fā)揮著重要作用[2]。因此，研究谷胱甘肽途徑及其關(guān)鍵基因?qū)沂局参锟鼓鏅C(jī)制具有非常重要的意義。

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferases，GSTs)是一種廣泛存在于自然界中的小分子多功能型水溶性蛋白[3]。GSTs一般通過促進(jìn)還原型谷胱甘肽與各種含親電基團(tuán)底物的相互作用，形成復(fù)合物，將有害物質(zhì)運(yùn)輸至體外，從而起到解毒消毒作用[4]。此外，GSTs參與細(xì)胞內(nèi)激素信號傳導(dǎo)、花青素的合成和運(yùn)輸?shù)冗M(jìn)程，同時受外界多種逆境脅迫因子的誘導(dǎo)，在植物生長發(fā)育、次生代謝等過程中也發(fā)揮著重要作用[5]。

研究表明，在植物體中，GST表達(dá)受到各種非生物脅迫，如缺磷[6]、鹽脅迫[7]的誘導(dǎo)。當(dāng)植物遭受逆境脅迫時，GSTs通過解毒和抗氧化作用避免植物細(xì)胞免受逆境傷害[4]。趙鳳云等[8]采用農(nóng)桿菌侵染法將鹽地堿蓬GST基因轉(zhuǎn)入對低溫敏感的水稻幼苗品種中花11中，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株應(yīng)對低溫脅迫的抗性明顯增強(qiáng)。戚元成等[9]發(fā)現(xiàn)鹽地堿蓬GST基因在擬南芥中過量表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱能力較對照明顯提高。此外，GST基因還能響應(yīng)真菌和其他一些病原物的侵染[10]，以及植物激素如生長素[11]、乙烯[12]和脫落酸[13]等的誘導(dǎo)。上述研究表明，GST基因在植物抵御各種生物和非生物脅迫的進(jìn)程中均起著非常重要的作用。

大蒜(AlliumsativumL.)為百合科蔥屬蔬菜作物，既可以作為調(diào)味，又具有較強(qiáng)的防病抗病功能。目前，在擬南芥[14]、水稻[15]、楊樹[16]、大豆[17]和甜橙[18]中已分別鑒定到55、79、81、94和23個GST基因，但關(guān)于大蒜中GST基因的研究尚未見報道。本研究以蒼山四六瓣為試驗(yàn)材料，克隆獲得大蒜GST基因，對其核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行分析，并利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)對該基因在鹽脅迫下的表達(dá)進(jìn)行研究，旨在探討基因與大蒜耐鹽能力的關(guān)系，為進(jìn)一步研究AsGST基因的生物學(xué)功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：大蒜品種蒼山四六瓣，來源于淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院玻璃溫室。大腸桿菌菌株由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院傘形科蔬菜作物實(shí)驗(yàn)室保存。

儀器設(shè)備：GenoSens 1850凝膠成像系統(tǒng)(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)、DYCP-32B電泳儀(北京六一儀器廠)、Centrifuge 5810R離心機(jī)(Eppendorf，美國)、Veriti 96-well Thermal Cycler PCR擴(kuò)增儀(Applied Biosystems，美國)、CFX96 Touch熒光定量PCR儀(Bio-rad，美國)。

主要試劑：植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]、DNA回收試劑盒(杭州唯特潔公司)、質(zhì)粒載體pMD19-T(大連TaKaRa公司)、Green Taq Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)、引物(南京金斯瑞生物科技有限公司)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(南京諾唯贊生物科技有限公司)、熒光定量試劑盒ChamQ SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物科技有限公司)。

1.2 方法

將蒼山四六瓣于2017年10月3日播種于按蛭石∶有機(jī)質(zhì)=1∶1(體積比)比例混合的基質(zhì)中，20 d后將大蒜幼苗轉(zhuǎn)移至60 cm×40 cm×20 cm水培箱(山東榮泉塑料制品有限公司)中進(jìn)行培養(yǎng)，營養(yǎng)液為Hogland標(biāo)準(zhǔn)配方。7 d后對大蒜植株進(jìn)行鹽脅迫(200 mmol·L-1NaCl)處理，處理時間分別為1、4、12 h，以未經(jīng)鹽脅迫處理的大蒜植株作為對照(CK)，每個處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。分別取大蒜葉片、根和鱗莖，立即用液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆?，用于RNA的提取及cDNA的合成。

1.2.1 RNA的提取及cDNA的合成 采用總RNA試劑盒提取總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2 大蒜GST基因的克隆 根據(jù)大蒜蒼山四六瓣轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(未公布)，檢索并拼接出GST基因序列，設(shè)計1對引物GST-F和GST-R，序列分別為5′-ATGTCTGAAGAAGTACTGTTGCTG-3′和5′-T TACTCTTCTATCCCAAGCTTCTT-3′，以蒼山四六瓣cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸50 s，共35個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳回收，與pMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，提取質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定后，送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。

1.2.3 序列分析 其他植物的GST序列均來自于NCBI數(shù)據(jù)庫，使用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列比對。利用軟件DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列比對和蛋白質(zhì)疏水性/親水性分析；采用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)軟件對氨基酸基本成分、蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)進(jìn)行分析；利用MEGA5對系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行測試和編輯，生成報告圖形[19]；利用SOPMA軟件分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)；通過Swiss-Model軟件預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)[20]。

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR 采用CFX 96 Touch系統(tǒng)(Bio-rad，美國)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。以大蒜SAND基因?yàn)閮?nèi)參基因，與目標(biāo)基因一起擴(kuò)增，每個處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，表達(dá)檢測引物為BD-SAND-F：5′-GCGTCAACGAATGTTCCAATTACCA-3′和BD-SAND-R：5′-TCTCTTCAGTCTCAACTTCATCAGCAT-3′。根據(jù)從蒼山四六瓣中擴(kuò)增的GST基因序列設(shè)計表達(dá)檢測引物BD-GST-F：5′-GCTAGGATCGCACTGGAAGAGA-3′和BD-GST-R：5′-GGTATCTCCTTCTCCGCATGA-3′。按照ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒的操作說明進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。

1.3 數(shù)據(jù)分析

以大蒜SAND基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平作為內(nèi)參，采用2-△△CT法[21]計算目的基因的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜GST基因的克隆

以蒼山四六瓣的cDNA為模板，分別以GST-F和GST-R作為上游和下游引物，PCR擴(kuò)增后得到1條長度約為700 bp的片段(圖1)。序列測定與分析表明，蒼山四六瓣的GST基因含有1個663 bp的開放閱讀框，編碼220個氨基酸(圖2)，將該基因序列上傳至GenBank，獲得登錄號MH892343。預(yù)測該基因編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為25.58 kDa，等電點(diǎn)為 6.55。

注：M: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(2 000 bp); 1: AsGST基因。Note: M: DNA marker(2 000 bp). 1: AsGST gene.圖1 大蒜AsGST基因的RT-PCR擴(kuò)增圖譜Fig.1 RT-PCR amplification patterns of AsGST gene from garlic

圖2 大蒜AsGST基因的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide acid sequences and predicted amino acid sequences of AsGST gene from garlic

2.2 大蒜AsGST的氨基酸序列和理化性質(zhì)分析

將大蒜AsGST的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對，結(jié)果顯示，該蛋白屬于tau類GST蛋白(圖3)。將該蛋白分別與蘋果(Malusdomestica，XP_008358506)、桃(Prunuspersica，XP_007200430)、海棗(Phoenixdactylifera，XP_008775488)、油棕(Elaeisguineensis，XP_010923805)、番茄(Solanumlycopersicum，XP_004240536)、辣椒(Capsicumannuum，XP_016576141)、馬鈴薯(Solanumtuberosum，XP_006355799)、蘿卜(Raphanussativus，XP_018455003)、芥菜(Brassicajuncea，AAP58393)、油菜(Brassicanapus，XP_022547908)、黃瓜(Cucumissativus，KGN53533)和苦瓜(Momordicacharantia，XP_022142875)等植物的tau類GST的氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)大蒜的GST基因編碼的蛋白序列與其他物種的GST氨基酸序列同源性較低，但在結(jié)構(gòu)上相對保守。在蛋白的N端含有谷胱甘肽特異結(jié)合位點(diǎn)(G位點(diǎn))，C端含有可變性較大的疏水底物結(jié)合位點(diǎn)(H位點(diǎn))(圖4)。

對大蒜和其他植物的GST氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析。由表1可知，這些植物中的GST氨基酸殘基數(shù)為213～222個，相對分子質(zhì)量為23.72～25.67 kDa。堿性氨基酸(包括精氨酸，賴氨酸和組氨酸)略多于酸性氨基酸(包括天冬氨酸和谷氨酸)，脂肪族氨基酸數(shù)量遠(yuǎn)高于芳香族氨基酸，不同氨基酸序列物理性質(zhì)存在差異。

圖3 大蒜AsGST氨基酸序列保守域預(yù)測Fig.3 Prediction of conserved domain of amino acid sequences of AsGST from garlic

注： # 表示GSH結(jié)合位點(diǎn)； *表示疏水底物結(jié)合位點(diǎn)。Note：# indicates the GSH binding site. * indicates the substrate binding site.圖4 大蒜GST與其他植物GST氨基酸序列的多重比對Fig.4 The alignment of amino acid sequences of GST from garlic and other plant species

2.3 大蒜GST的氨基酸親水性和疏水性預(yù)測

對蒼山四六瓣GST基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行疏水性/親水性分析。結(jié)果表明，該蛋白的第123位谷氨酸(Glu)親水性最強(qiáng)，其次為第118和第119位的甘氨酸(Gly)和谷氨酸(Glu)；疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)為第157位的異丙氨酸(Phe)，其次為第155位的異亮氨酸(Ile)(圖5)。

2.4 大蒜GST的進(jìn)化樹分析

由圖6可知，蒼山四六瓣GST與茄科作物的進(jìn)化關(guān)系較為接近，十字花科中蘿卜、芥菜、油菜的GST屬于同一個分支，薔薇科中蘋果和桃的GST屬于同一個分支，棕櫚科中海棗、油棕的GST屬于同一個分支，葫蘆科中黃瓜和苦瓜的GST屬于同一個分支，茄科中的辣椒、番茄、馬鈴薯的GST屬于同1個分支。

2.5 大蒜GST三級結(jié)構(gòu)分析

利用在線軟件SOPMA分析二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明AsGST蛋白質(zhì)中α-螺旋占55.00%，延伸鏈占11.82%，β-轉(zhuǎn)角占5.45%，無規(guī)則卷曲占27.73%。以玉米GST(PDB ID：4chs.1.B)為模板，通過SWISS-MODEL在線軟件對該蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)分析，其N端主要由β-折疊和α-螺旋構(gòu)成(βαβαβα)，C端由8個α-螺旋構(gòu)成，通過一個約10個氨基酸的短序列與N端結(jié)構(gòu)域連接(圖7)。

表1 不同物種的GST氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析Table 1 Comparison of composition and physico chemical features of amino acid sequences of GST from different plant species

圖5 大蒜AsGST氨基酸序列的親水性和疏水性分析Fig.5 Analysis of hydrophilcity and hydrophobicity of amino acid sequences of AsGST from garlic

2.6 鹽脅迫條件下大蒜GST基因的表達(dá)分析

由圖8可知，正常條件下，蒼山四六瓣中GST在鱗莖、葉和根中均有表達(dá)，在根中的表達(dá)量最高，其次是葉，在鱗莖中的表達(dá)量較低。鹽脅迫處理1 h時，AsGST基因的表達(dá)量較CK無明顯變化，但隨著鹽脅迫處理時間的延長，蒼山四六瓣中GST基因在鱗莖、葉和根中的表達(dá)量均呈上升趨勢，且在處理4 h時達(dá)到最高。鹽脅迫處理12 h時，AsGST基因在葉和根中的表達(dá)量較處理4 h有明顯下降，但鱗莖中的表達(dá)量變化不明顯。

3 討論

圖6 大蒜與其他植物GST氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of GST from garlic and other plant species

圖7 AsGST蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 The deduced three-dimensional structure of AsGST

圖8 大蒜AsGST基因在鹽脅迫條件下的表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of AsGST gene under salt stress from garlic

研究表明，遭遇逆境脅迫時，植物體內(nèi)活性氧含量會大量升高，對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝物質(zhì)造成氧化傷害，嚴(yán)重影響甚至擾亂植物的正常生長、發(fā)育和代謝[22-24]。而由GST、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)和過氧化物酶(peroxidase，POD)等形成的保護(hù)酶系統(tǒng)，能夠有效地清除植物體內(nèi)的活性氧及其他自由基，消除細(xì)胞內(nèi)的有害代謝物質(zhì)，從而保護(hù)植物免受或減緩傷害[25]。其中，GST作為一個大的基因家族，在植物生長發(fā)育、響應(yīng)環(huán)境變化的過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[26]。因此，研究GST有助于闡明植物生長和抵御脅迫的分子機(jī)制，對改善脅迫下植物的生存能力具有實(shí)際意義。

GSTs一般以25～27 kDa的2條亞基以同源或異源的方式聚合而成，每個亞基都含有2個空間結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)域：N端由β折疊和α螺旋構(gòu)成；C端主要由α螺旋構(gòu)成[27]。本研究克隆獲得的大蒜AsGST基因?qū)儆趖au類GST家族成員，其編碼的蛋白質(zhì)與其他12種植物中GST序列相似性較低，但在結(jié)構(gòu)上相對保守，N端具有保守的結(jié)合谷胱甘肽的G位點(diǎn)，C端的H位點(diǎn)可結(jié)合疏水底物[3]，在空間結(jié)構(gòu)上與前人研究結(jié)果類似[26]，N端主要由β折疊和α螺旋構(gòu)成(βαβαβα)，C端由8個α螺旋構(gòu)成，通過1個約10個氨基酸的短序列與N端結(jié)構(gòu)域連接。

在玉米(ZeamaysL.)的研究中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)GST基因在根中表達(dá)水平較高，而在其他組織中表達(dá)相對較低[28]。本研究中，AsGST基因在大蒜各組織中的表達(dá)水平差異明顯，在根中的表達(dá)量最高，其次是葉，在鱗莖中的表達(dá)量較低，呈現(xiàn)明顯的組織特異性。GSTs不僅在細(xì)胞代謝和異源化合物的解毒過程中發(fā)揮重要功能，對植物抵御不良環(huán)境和損傷等方面同樣起著重要作用。前人研究表明，干旱、真菌攻擊、鹽脅迫等均能誘導(dǎo)GSTs的表達(dá)[29-31]。過表達(dá)大豆GmGSTL1基因提高了煙草BY-2細(xì)胞和擬南芥在鹽脅迫下的存活率和抗性[32]。類似地，擬南芥中過表達(dá)番茄GST基因增強(qiáng)了其在鹽脅迫和干旱脅迫條件下的生長勢[33]。本研究中，鹽脅迫后，大蒜各組織均可響應(yīng)誘導(dǎo)，鹽脅迫處理4 h時，各組織內(nèi)該基因的表達(dá)量升至最高，與前人研究結(jié)果一致，說明GST參與植物抵御鹽脅迫的具體途徑可能是通過將鹽脅迫產(chǎn)生的有毒害作用的活性氧還原，從而減少對細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的損壞，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，克隆的大蒜AsGST基因?qū)儆趖au類GST家族成員，在根中的表達(dá)量最高，其次是葉，在鱗莖中的表達(dá)量較低，具有明顯的組織特異性。鹽脅迫處理4 h時，各組織內(nèi)AsGST基因的表達(dá)量均升至最高，說明AsGST基因可能與植物耐鹽性有著密切的關(guān)系，其可能在大蒜抵御鹽脅迫的機(jī)制中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但其具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果為鑒定大蒜GST基因功能的奠定了一定的理論基礎(chǔ)。