鄭克思 鄭翔 曾勇 陳聰 吳元肇 鄭克文

乳腺癌是一種嚴(yán)重危害婦女健康的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，其發(fā)病率均呈大幅上升趨勢(shì)，但隨著生物技術(shù)的發(fā)展，新型靶向藥物研制的成功，使乳腺癌患者的預(yù)后得到很大的改善[1]。但乳腺癌作為一種異質(zhì)性腫瘤，各亞型在自然病程和治療反應(yīng)方面差異較大，因此繼續(xù)尋找一種特異性生物標(biāo)志物應(yīng)用于乳腺癌預(yù)后的判斷及新型靶向藥物的研制，已經(jīng)成為乳腺癌治療的一種必然。目前大量的研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞周期調(diào)控異常有關(guān)，而細(xì)胞周期特異性蛋白D1（cyclin D1）是調(diào)控細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白，已被證實(shí)為原癌基因，其過(guò)度表達(dá)可以導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。而在腫瘤中，人抗原R（HuR）作為一種RNA結(jié)合蛋白，主要通過(guò)基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管生成和淋巴管生成等過(guò)程。相關(guān)研究表明，在卵巢癌、胃癌、乳腺癌、宮頸癌等腫瘤組織中均能檢測(cè)到HuR、cyclinD1的過(guò)表達(dá)[2-7]。本文以人乳腺癌MCF-7細(xì)胞為研究對(duì)象，探討HuR通過(guò)cyclinD1對(duì)乳腺癌細(xì)胞行為的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 MCF-7人乳腺癌細(xì)胞株（武漢普諾賽公司）；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胰蛋白酶、FBS、1%青鏈霉素（美國(guó)Gibco公司）；pU6gRNACas9EGFP載體及pIRES2-ZsGreen載體（美國(guó) Addgene公司）；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol試劑（美國(guó)Invitrogen公司）；RT-PCR試劑盒、T4 DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶Xho I、EcoR I（大連 Takara公司）；DNA 膠回收試劑盒（上海生工公司）；Transwell小室（美國(guó)Corning公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、MTT檢測(cè)試劑盒（上海碧云天公司）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（南京凱基公司）；HuR抗體、cyclin D1抗體；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗（武漢三鷹公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將MCF-7細(xì)胞放在含有10%FBS和1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃、5%CO2環(huán)境下生長(zhǎng)。細(xì)胞融合至80%左右時(shí)常規(guī)傳代。將MCF-7細(xì)胞分為對(duì)照組、HuR過(guò)表達(dá)組（構(gòu)建HuR過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染）、HuR敲低組（構(gòu)建HuR敲低載體并轉(zhuǎn)染）。

1.2.2 HuR過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染 按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取MCF-7細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增：Premix Taq 12.5μl、上下游引物各 1μl、模板 2μl、加 ddH2O 至 25μl的反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為 94℃ 5 min，94℃ 30s，61℃30s，72℃ 2min，共 30 個(gè)循環(huán)，72℃延伸 10min，電泳后切膠回收HuR基因片段。用限制性?xún)?nèi)切酶Xho I、EcoR I將回收的HuR片段與載體pIRES2-ZsGreen分別進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用T4 DNA連接酶構(gòu)建HuR過(guò)表達(dá)載體，并進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。

1.2.3 HuR敲低載體的構(gòu)建 使用CRISPR在線設(shè)計(jì)工具（http://crispr.mit.edu/）設(shè)計(jì)HuR基因的 gRNA（序列：5′-AGAGCGATCAACACGCTGAA-3′；上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成），退火成雙鏈后，連接克隆到經(jīng)Bbs I酶切的pU6gRNACas9EGFP載體上。然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)的大腸桿菌DH5α后，挑單克隆提取質(zhì)粒和測(cè)序分析，驗(yàn)證得到正確克隆的質(zhì)粒。

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)HuR、cyclinD1 mRNA的表達(dá) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后分別收集HuR過(guò)表達(dá)組和HuR敲低組細(xì)胞，同時(shí)收集對(duì)照組細(xì)胞。按照TRIzol試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以此cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR。選取GAPGH作為內(nèi)參，利用2-ΔΔCT相對(duì)定量法測(cè)定并計(jì)算HuR、cyclinD1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。各基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 各基因引物序列

1.2.5 Western blot檢測(cè) HuR、cyclinD1蛋白的表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后分別收集對(duì)照組、HuR過(guò)表達(dá)組、HuR敲低組細(xì)胞，細(xì)胞裂解液4℃裂解，12 000r/min離心30min，吸取上清液獲取總蛋白。根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳2.5h，轉(zhuǎn)膜后NC膜TBS稍蕩洗，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，4℃下分別孵育HuR、cyclinD1一抗過(guò)夜，TBST洗10min×3次，室溫孵育二抗1h，TBST洗10min，重復(fù)3次，曝光顯影；采用BIO-RAD Image Lab軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.2.6 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行MTT檢測(cè)。將對(duì)照組、HuR過(guò)表達(dá)組、HuR敲低組細(xì)胞接種于96孔板。每孔加入10μl MTT，37℃孵育4h，吸出培養(yǎng)基，加入150μl DMSO震蕩10min，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在波長(zhǎng)568nm下的吸光度值（OD）。

1.2.7 Annexin V－APC/7－AAD雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后分別收集對(duì)照組、HuR過(guò)表達(dá)組及HuR敲低組的細(xì)胞。預(yù)冷PBS洗2～3次，調(diào)整細(xì)胞濃度至 5×105/ml，加入 100μl Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入5μl Annexin V－APC 和 5μl 7－AAD 染液混勻，避光室溫孵育 10min。再次加入 400μl 1×BindingBuffer。然后樣品于流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.2.8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后分別收集對(duì)照組、HuR過(guò)表達(dá)組及HuR敲低組的細(xì)胞。用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞濃度至2×105/ml。在24孔板中加入800μl 10%含F(xiàn)BS培養(yǎng)基，并放入transwell小室，在transwell上室分別接入200μl各組細(xì)胞懸液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48h。取出 transwell，用 PBS 小心清洗小室1遍，用70%冰乙醇溶液固定細(xì)胞1h。用0.5%結(jié)晶紫染液染色，室溫中放置20min，PBS清洗，用干凈的棉球?qū)⑸鲜乙粋?cè)未遷移的細(xì)胞擦干凈，顯微鏡下觀察拍照，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HuR過(guò)表達(dá)載體及敲低載體構(gòu)建 構(gòu)建的HuR過(guò)表達(dá)及敲低載體經(jīng)測(cè)序分析表明插入的序列及位點(diǎn)正確，目的基因HuR的過(guò)表達(dá)及敲低載體質(zhì)粒構(gòu)建成功，見(jiàn)圖1。

圖1 HuR過(guò)表達(dá)載體及敲低載體質(zhì)粒測(cè)序鑒定（a：HuR過(guò)表達(dá)載體部分測(cè)序結(jié)果；b：HuR敲低載體部分測(cè)序結(jié)果）

2.2 HuR對(duì)MCF－7細(xì)胞增殖的影響 見(jiàn)圖2。

圖2 HuR對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響（與對(duì)照組比較，**P＜0.01）

由圖2可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，HuR過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的增殖率顯著增加（t=－18.29，P＜0.01），HuR敲低組細(xì)胞的增殖率顯著降低（t=13.83，P＜0.01）。

2.3 HuR對(duì)MCF－7細(xì)胞遷移的影響 見(jiàn)圖3。

圖3 HuR對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移的影響（a：對(duì)照組MCF-7細(xì)胞的HE染色圖，b：HuR過(guò)表達(dá)組MCF-7細(xì)胞的HE染色圖，c：HuR敲低組MCF-7細(xì)胞的HE染色圖，×200；d：各組細(xì)胞遷移數(shù)量的柱形圖，與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

由圖3可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，HuR過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的遷移數(shù)量增加（t=－4.57，P＜0.05），HuR 敲低組細(xì)胞的遷移數(shù)量降低（t=3.91，P＜0.05）。

2.4 HuR對(duì)MCF－7細(xì)胞凋亡的影響 見(jiàn)圖4。

由圖4可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，HuR過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的凋亡率顯著降低（t=3.70，P＜0.05），HuR敲低組細(xì)胞的凋亡率顯著升高（t=－45.32，P＜0.01）。

2.5 HuR對(duì)cyclinD1表達(dá)的影響 見(jiàn)圖5。

由圖5可見(jiàn)，與對(duì)照組比較，HuR過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中HuR、cyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著升高（t=－10.55、－6.75，均P＜0.01），HuR敲低組細(xì)胞中HuR、cyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低（t=21.35、4.33，P＜0.05 或 0.01）。與對(duì)照組比較，HuR過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中HuR、cyclinD1 mRNA表達(dá)水平顯著升高（t=-11.70、-9.34，均P＜0.01），HuR敲低組細(xì)胞中HuR、cyclinD1 mRNA表達(dá)水平顯著降低（t=21.88、9.55，均P＜0.01）。

圖4 HuR對(duì)MCF-7細(xì)胞凋亡率的影響（注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

HuR是RNA結(jié)合蛋白中胚胎致死異常視覺(jué)（ELAV）家族的重要一員，其基因在機(jī)體各組織中廣泛表達(dá)，通過(guò)調(diào)控靶mRNA的穩(wěn)定性和（或）翻譯效率來(lái)影響靶基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平，而且這種調(diào)控多以正向調(diào)控為主，從而參與細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控[8-12]。在生理狀態(tài)下，HuR主要定位在細(xì)胞核，功能是與靶基因的mRNA結(jié)合形成復(fù)合物，穿梭到胞質(zhì)，在此過(guò)程中HuR保護(hù)mRNA避免衰變降解；在病理狀態(tài)下，HuR胞質(zhì)表達(dá)增加，阻止含AREs靶基因脫腺苷化降解過(guò)程，延長(zhǎng)mRNA的壽命，使其蛋白異常增加[8-12]。近年來(lái)研究表明，HuR與人乳腺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌、卵巢癌和胃癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能是影響胃癌、乳腺癌、大腸癌等預(yù)后的因素[2-7]。2005年，Heinonen等[13]發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)HuR表達(dá)與HER2陰性、PR和ER陽(yáng)性、p53表達(dá)、癌腫的分級(jí)及管狀分化表型相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)HuR在細(xì)胞質(zhì)中的高表達(dá)可以作為浸潤(rùn)性導(dǎo)管乳腺癌診斷的分子標(biāo)志。在本研究中，HuR過(guò)表達(dá)組細(xì)胞的增殖率和遷移數(shù)量顯著增加，細(xì)胞凋亡率降低；HuR敲低組細(xì)胞的增殖率和遷移數(shù)量顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高。表明HuR可以促進(jìn)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖和遷移活動(dòng)，降低MCF-7細(xì)胞的凋亡。

圖5 HuR對(duì)cyclinD1表達(dá)的影響（a：各組HuR、cyclinD1蛋白表達(dá)水平柱狀圖；b：各組HuR、cyclinD1 mRNA表達(dá)水平柱狀圖；c：各組HuR、cyclinD1 蛋白電泳圖。注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

細(xì)胞增殖呈周期性變化，增值周期中有多個(gè)調(diào)控點(diǎn)，其中最重要的是起始調(diào)控點(diǎn)即G1-S間的前期調(diào)控點(diǎn)，此點(diǎn)主要由cyclinD1決定，當(dāng)受生長(zhǎng)因子刺激cyclinD1增多，與CDK4/CDK6結(jié)合使其活化為蛋白激酶，使Rb蛋白磷酸化，Rb蛋白磷酸化后構(gòu)象改變而轉(zhuǎn)錄因子E2F分離使其發(fā)揮強(qiáng)大的轉(zhuǎn)錄作用使細(xì)胞增殖[14-15]。大量研究表明，腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞周期調(diào)控異常有關(guān)，cyclinD1已被證實(shí)為原癌基因，它們的過(guò)度表達(dá)或錯(cuò)誤調(diào)控均可導(dǎo)致細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[14-15]。目前研究cyclinD1含295氨基酸，由染色體上11q13上的CCND1基因編碼，動(dòng)物模型和細(xì)胞培養(yǎng)表明cyclinD1蛋白過(guò)度表達(dá)可使細(xì)胞周期縮短，對(duì)分裂原的依賴(lài)性減弱[14-15]。有人應(yīng)用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)cyclinD1 cDNA導(dǎo)入生育期小鼠中，發(fā)現(xiàn)乳腺組織CCND1擴(kuò)增，其中8只小鼠發(fā)展為乳腺癌并不同程度合并其他腫瘤，證明了CCND1作為原癌基因在乳腺癌形成過(guò)程中起重要的促進(jìn)作用[16]。在乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)中Buckley觀察了20種癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)25%的樣本存在cyclinD1基因的表達(dá)升高，45%的樣本其mRNA水平較正常高[17-18]；而乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)大約一半的浸潤(rùn)癌cyclinD1蛋白的表達(dá)水平高于正常上皮，cyclinD1可作為乳腺癌腫瘤標(biāo)記之一[17-18]。胡向陽(yáng)等[19]用免疫組化的方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)乳腺癌中cyclinD1表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于良性乳腺組織，cyclinD1表達(dá)出現(xiàn)于導(dǎo)管內(nèi)癌并持續(xù)于浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移等過(guò)程中，與年齡、腫瘤大小、組織學(xué)類(lèi)型等無(wú)相關(guān)性，但與組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)。O′Connor等[20]報(bào)道cyclin D1在乳腺癌中的過(guò)表達(dá)與預(yù)后呈正相關(guān)。

HuR參與細(xì)胞周期的調(diào)控，研究表明，HuR蛋白能夠通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié) p21、p27、cyclinA、cyclinB1、p53等多種與細(xì)胞周期相關(guān)的基因在細(xì)胞中的表達(dá)[21-24]。在肺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)，豬苓多糖能通過(guò)HuR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后途徑調(diào)控A549細(xì)胞cyclin D1表達(dá)[25]。在人腎臟系膜細(xì)胞中，研究表明在血管緊張素Ⅱ刺激下可促使胞核內(nèi)HuR蛋白向胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)移增強(qiáng)cyclinD1蛋白表達(dá)進(jìn)而刺激人腎小球系膜細(xì)胞增殖[26]。細(xì)胞周期蛋白可分為3類(lèi)：S期周期蛋白，M期周期蛋白，G1期周期蛋白。S期周期蛋白為cyclin A，M期周期蛋白為cyclin B，G1期周期蛋白為cyclin C、D、E。相關(guān)文獻(xiàn)表明HuR能調(diào)控各周期蛋白的表達(dá)，Guo等[27]發(fā)現(xiàn)微小RNA可以通過(guò)HuR調(diào)節(jié)cyclin E1在乳腺癌中的表達(dá)，Schroeder等[28]發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞增殖過(guò)程中HuR調(diào)控cyclin A和cyclinB1 mRNA的穩(wěn)定性。在本研究中，cyclinD1在HuR過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，在HuR敲低組中顯著降低，提示HuR可能通過(guò)上調(diào)cyclinD1的表達(dá)，影響細(xì)胞周期，從而促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。

本研究以熒光定量PCR及Western blot檢測(cè)HuR、cyclinD1蛋白及mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，HuR過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中HuR、cyclinD1蛋白及mRNA的表達(dá)水平顯著升高，HuR敲低組細(xì)胞中HuR、cyclinD1蛋白及mRNA的表達(dá)水平顯著降低，提示HuR與cyclinD1在乳腺癌演進(jìn)過(guò)程中有協(xié)同作用。目前研究認(rèn)為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)mRNA產(chǎn)物的最具特征性的順式作用元件是AREs（富含腺嘌呤A和尿嘧啶U的序列），定位在許多不穩(wěn)定mRNA的3′非翻譯保守區(qū)（3′UTR），而在HuR蛋白上有3個(gè)RNA識(shí)別模序（RRMs），可以與AREs特定位點(diǎn)結(jié)合[8-12]。HuR作為一種mRNA結(jié)合蛋白，連接于3′UTR含有AREs的短壽命mRNA，可以抑制該mRNA的快速衰變降解，從而增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄后翻譯的能力[8-12]。HuR蛋白已被證實(shí)可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié) cyclinA、cyclinB1、c-fos、VEGF、TNF-α、β 連接素（β-catenin）、c-Myc、COX-2、myogenin、MyoD、GMCSF、p21、p27、p53 與 HSP70 等多種基因在細(xì)胞中的表達(dá)，而相關(guān)的研究顯示這些基因的mRNA都富含AREs[21-24]。目前cyclinD1基因的mRNA亦被證實(shí)富含AREs，提示cyclin D1的過(guò)表達(dá)可能是通過(guò)HuR穩(wěn)定其mRNA實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，HuR可能通過(guò)上調(diào)cyclinD1的表達(dá)，影響細(xì)胞周期，從而促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。因此，HuR、cyclinD1基因可能為乳腺癌的新治療靶點(diǎn)。