馬艷雯，高華利，李倩文，于俊杰，呂志偉

(聊城大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 聊城 252059)

中國是世界第一的秸稈大國，秸稈資源豐富，每年秸稈產(chǎn)量達(dá)到8億t以上，占全球秸稈總量的20%[1]。隨著農(nóng)村生活水平的不斷提高，秸稈作為家庭燃料的利用比例降低，大量秸稈被露天焚燒。秸稈焚燒給環(huán)境帶來污染，容易引發(fā)火災(zāi)，給道路帶來安全隱患，使得土壤結(jié)構(gòu)遭到破壞，同時(shí)也給人類帶來極大的危害[2]。纖維素是地球上分布最廣、數(shù)量最大的可再生資源[3]，玉米秸稈作為中國產(chǎn)量最高的三大作物秸稈之一[4]，富含纖維素，對(duì)于研究如何科學(xué)高效地利用秸稈資源具有重大的實(shí)踐意義。

秸稈中含有豐富的有機(jī)質(zhì)，含有氮、磷、鉀、鈣、鎂等元素[5]，是一種綠色的、可持續(xù)利用的資源，因此秸稈還田成為一項(xiàng)綠色環(huán)保同時(shí)又增產(chǎn)增肥的重要舉措。但是，目前秸稈還田所面臨的問題之一是秸稈資源利用率低，經(jīng)濟(jì)效益差。

產(chǎn)纖維素酶的菌很多，近年來報(bào)道的有曲霉、木霉、芽孢桿菌、青霉、根霉等[6-10]。如焦有宙等[11]通過比較不同土著菌及其復(fù)合菌對(duì)玉米秸稈降解的影響，研究出黑曲霉、綠色木霉對(duì)秸稈中纖維素、半纖維素體現(xiàn)了較高的降解能力。李立波等[12]探究了哈茨木霉(Trichodermaharzianum)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)這2種菌株在固態(tài)發(fā)酵條件下降解玉米秸稈的效果。本實(shí)驗(yàn)室篩選到一種硫色曲霉，經(jīng)初步檢測(cè)，木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶活性較高，并且有研究表明，硫色曲霉固態(tài)發(fā)酵獲得的復(fù)合酶系中含有較高活性的木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶、纖維素酶等，且硫色曲霉對(duì)于淀粉、麥麩和豆粕具有良好的降解效果，在飼料酶的生產(chǎn)應(yīng)用中有很大的潛力[13-15]。然而，目前關(guān)于硫色曲霉以秸稈為主要發(fā)酵原料進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶的研究很少。

因此，本課題研究了不同碳源、氮源、發(fā)酵溫度、烘干溫度、培養(yǎng)時(shí)間以及不同初始pH條件對(duì)硫色曲霉SQ-3木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶3種酶活性的影響，為硫色曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的研究填補(bǔ)了的空白，以期獲得相對(duì)最適的培養(yǎng)條件，為秸稈的高效利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

硫色曲霉SQ-3(AspergillarsulphureusSQ-3)，由聊城大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試劑

DNS(3，5-二硝基水楊酸)購自國蘇集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；羥甲基纖維素和木聚糖購自美國Sigma-Aldrich公司；酒石酸鈉、硝酸鈉、亞硫酸鈉、乙酸、醋酸鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、硫酸鎂購自天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；苯酚、蔗糖、淀粉、蛋白胨和瓊脂購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將硫色曲霉SQ-3接到察氏培養(yǎng)基上，培養(yǎng)3 d，進(jìn)行活化。之后將菌種接到種子培養(yǎng)基(即初始培養(yǎng)基，麥麩33.2%，豆粕5.8%，玉米秸稈粉1.0%，1% NaNO3溶液 60%)上，28 ℃培養(yǎng)3 d，待用。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 酶活性的定義與測(cè)定

酶活性定義為每分鐘催化釋放產(chǎn)生1 μmol還原糖(葡萄糖、麥芽糖、木糖)所需的酶量為1個(gè)纖維素酶、淀粉酶和木聚糖酶活性單位(U)。

將發(fā)酵培養(yǎng)基置于37 ℃和-20 ℃下凍融3次，加入3倍體積的水，搖床萃取，抽濾，取濾液采用DNS法[16-17]測(cè)定酶活性。將抽濾后的發(fā)酵料于60 ℃烘干至恒重以計(jì)算活性，單位為U·g-1。

1.3.2 相對(duì)酶活性的計(jì)算

相對(duì)酶活性的計(jì)算公式A=Ex/Emax×100%。其中，A—相對(duì)酶活性；Ex—樣品酶活性；Emax—實(shí)驗(yàn)條件下每組中的最高酶活性。

1.3.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

采用初始培養(yǎng)基，接種后在28 ℃、初始pH為7.0的條件下分別培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 d，提取酶液分別測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的酶活性，以確定適宜的發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間。

1.3.4 初始pH值對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

將初始培養(yǎng)基pH值調(diào)整為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他條件不變，分別測(cè)定酶活性。

1.3.5 發(fā)酵溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

將初始培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度分別設(shè)為24、28、32和36 ℃，其他條件不變，分別測(cè)定酶活性。

1.3.6 不同氮源、碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物酶活性的影響

分別改變初始培養(yǎng)基中豆粕、蛋白胨、麥麩和玉米秸稈粉的含量，培養(yǎng)時(shí)間為3 d，其他條件不變，分別測(cè)定酶活性(具體培養(yǎng)基成分見表1)。

1.3.7 烘干溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物酶活性的影響

綜合1.3.3節(jié)-1.3.6節(jié)不同培養(yǎng)條件對(duì)硫色曲霉產(chǎn)酶活性的影響，選取相對(duì)最適的培養(yǎng)條件(表1，C4組)，將得到的發(fā)酵料分別置于40、45、50、55、60 ℃的烘箱中烘干至恒重，進(jìn)行殘余酶活性的測(cè)定。

1.3.8 烘干溫度對(duì)孢子存活數(shù)的影響

利用稀釋平板法[18]測(cè)定孢子存活數(shù)并進(jìn)行孢子計(jì)數(shù)。培養(yǎng)條件同1.3.7節(jié)，將得到的發(fā)酵料分別置于40、45、50、55、60、65 ℃下烘干至恒重，測(cè)定孢子數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0進(jìn)行作圖，利用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2007對(duì)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)硫色曲霉SQ-3酶活性的影響

由圖1可知，木聚糖酶的活性在第2天即達(dá)最高峰，纖維素酶和淀粉酶分別在第3天和第5天時(shí)達(dá)到最高峰，之后均開始下降。在第3天時(shí)，木聚糖酶活性為最高酶活力的68.7%，淀粉酶活性為最高酶活力的85.1%，是3種酶活性均相對(duì)較高的產(chǎn)酶時(shí)間。

圖1 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)硫色曲霉SQ-3酶活性的影響Fig.1 Effects of different culture time on activities of cellulase， amylase and xylanase produced by Aspergillar sulphureus SQ-3

2.2 不同初始pH值對(duì)硫色曲霉SQ-3三種酶活性的影響

圖2顯示了在不同初始pH值條件下，硫色曲霉SQ-3三種酶活性的變化趨勢(shì)。在初始pH值為酸性及近中性的條件(pH 4.0～7.0)下，木聚糖酶活性變化較小，在初始pH 7.0時(shí)相對(duì)酶活性最高。在初始pH值為偏堿性的環(huán)境下活性迅速下降。纖維素酶和淀粉酶活性都呈先上升后下降的趨勢(shì)，分別在初始pH 7.0和pH 6.0的條件下相對(duì)酶活性最高。在pH 7.0時(shí)，淀粉酶活性為最高酶活性的95.7%。

2.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)硫色曲霉SQ-3三種酶活性的影響

不同的培養(yǎng)溫度對(duì)3種酶會(huì)產(chǎn)生不同的影響。

圖2 不同初始pH值對(duì)硫色曲霉SQ-3酶活性的影響Fig.2 Effects of different initial pH values on activities of cellulase， amylase and xylanase produced by Aspergillar sulphureus SQ-3

圖3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)硫色曲霉酶活性的影響Fig.3 Effects of different culture temperature on activities of cellulase， amylase and xylanase produced by Aspergillar sulphureus SQ-3

木聚糖酶在24 ℃的條件下相對(duì)酶活性最高，隨著培養(yǎng)溫度的上升，酶活性呈現(xiàn)出一直下降的趨勢(shì)。纖維素酶和淀粉酶活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，在28 ℃的條件下最高；在此條件下，木聚糖酶為最高酶活性的88.9%(圖3)。

2.4 不同氮源、碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物酶活性的影響

由表1可知，在N1-N6組中，以豆粕為氮源時(shí)，纖維素酶與淀粉酶的活性受豆粕含量影響較大，木聚糖酶活性受影響較小。以蛋白胨為氮源時(shí)，隨著氮源含量的增加，纖維素酶活性升高，木聚糖酶與淀粉酶活性降低。在C1-C5組中，改變麥麩與玉米秸稈粉的比例，可見，C4組中木聚糖酶與纖維素酶活性最大，而淀粉酶活性在C1組中最大(P<0.05)。

2.5 不同烘干溫度對(duì)硫色曲霉三種酶活性的影響

不同的烘干溫度對(duì)硫色曲霉SQ-3發(fā)酵料中的酶活性具有顯著影響。隨著烘干溫度的升高，木聚糖酶活性迅速下降，在烘干溫度為40 ℃時(shí)相對(duì)酶活性最高；淀粉酶和纖維素酶的相對(duì)酶活性先升高后降低，分別在45 ℃、50 ℃時(shí)達(dá)到最高酶活性。在50 ℃下，木聚糖酶活性僅為最高酶活性的37.8%，淀粉酶活性則為最高酶活性的91.9%(圖4)。

2.6 不同烘干溫度對(duì)孢子活性的影響

由圖5可知，孢子存活數(shù)受溫度的影響較大。隨著烘干溫度的升高，活孢子數(shù)明顯下降，在烘干溫度為40 ℃時(shí)，活孢子數(shù)不低于1.1×108g-1，在45 ℃時(shí)，活孢子數(shù)則迅速下降到40 ℃時(shí)的18.4%。

表1 不同氮源、碳源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物酶活的影響

Table1Effects of different nitrogen sources and carbon sources on enzyme activity of fermentation production

序號(hào)Test No.麥麩Wheatbran/%玉米秸稈粉Corn strawPowder/%豆粕Soybeanmeal/%蛋白胨Peptone/%1% NaNO3/%纖維素酶Cellulase/(U·g-1)木聚糖酶Xylanase/(104 U·g-1)淀粉酶Amylase/(103 U·g-1)N136.91.02.10.060.0259.3±13.3 b9.1±0.5 a10.0±0.9 aN235.01.04.00.060.0238.3±12.6 b7.4±0.1 c8.7±0.1 bN333.21.05.80.060.0362.7±35.2 a9.9±0.3 a8.5±0.5 beN436.91.00.02.160.0300.3±42.0 a9.4±0.4 a8.4±0.6 beN535.01.00.04.060.0332.6±40.8 a7.9±0.0 b7.8±0.2 ceN633.21.00.05.860.0410.8±70.3 a6.5±0.0 d7.1±0.2 dC133.21.05.80.060.0362.7±35.2 ae9.9±0.3 ce8.5±0.5 aC224.79.55.80.060.0335.8±15.7 be10.9±0.9 be6.2±0.5 bC316.717.35.80.060.0281.3±3.7 c11.7±0.4 b5.4±0.4 bC48.525.75.80.060.0453.3±66.6 a14.8±0.2 a3.9±0.1 c

同列不同行數(shù)據(jù)后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

The data within the same column followed without the same letters indicated significant difference atP<0.05.

圖4 不同烘干溫度對(duì)硫色曲霉酶活性的影響Fig.4 Effects of different baking temperature on activities of cellulase， amylase and xylanase produced by Aspergillar sulphureus SQ-3

圖5 不同烘干溫度對(duì)孢子活性的影響Fig.5 Effect of different baking temperature on survivability of this fungus

3 討論

硫色曲霉能夠在以秸稈為主要成分的發(fā)酵培養(yǎng)基中快速生長(zhǎng)，在第2天時(shí)，發(fā)酵料中木聚糖酶活性達(dá)最高峰，纖維素酶在第3天達(dá)到最高峰，與陸文清等[13]相關(guān)研究報(bào)道相比，實(shí)驗(yàn)所需的產(chǎn)酶時(shí)間較短、酶活力較強(qiáng)、產(chǎn)酶效率較高(表1)。

環(huán)境中的pH值會(huì)影響到細(xì)胞膜所帶電荷量，從而引起細(xì)胞對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)吸收狀況的變化[19]。圖2結(jié)果顯示，初始pH值為6.0～7.0偏中性時(shí)，3種酶的活性均較高，其中3種酶活性在pH值為7.0時(shí)均最高，此前已有報(bào)道證實(shí)[20-21]。該實(shí)驗(yàn)條件有助于簡(jiǎn)化固體發(fā)酵產(chǎn)酶的工序，使得工業(yè)化生產(chǎn)成為可能。

由圖3可知，在28 ℃下，木聚糖酶活性為最高酶活性的88.9%，淀粉酶活性為最高酶活性的83.9%，纖維素酶活性達(dá)到最大，與有關(guān)報(bào)道[22-23]結(jié)果基本一致，屬于室溫的溫度范圍。因此，在實(shí)際生產(chǎn)過程中，可有助于減少能源消耗。

由表1可知，相對(duì)于蛋白胨，氮源為豆粕(占5.8%)時(shí)，酶活性仍較高，可以作為主要氮源以降低生產(chǎn)成本。碳源主要為玉米秸稈粉(占25.7%)時(shí)，纖維素酶與木聚糖酶活性最大，淀粉酶活性也較高。相對(duì)于此前報(bào)道的利用玉米芯產(chǎn)木聚糖酶[24]的實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)利用農(nóng)業(yè)廢棄物玉米秸稈培養(yǎng)硫色曲霉時(shí)產(chǎn)酶量更高，對(duì)秸稈還田及工業(yè)生產(chǎn)具有重要的實(shí)際意義。

纖維素酶比較耐熱，在50 ℃下烘干時(shí)的活性最大，而木聚糖酶的耐熱性較差(僅為最高酶活力的37.8%)，淀粉酶則保存了91.9%的活性。纖維素酶對(duì)于纖維素分子的降解，一般要吸附到纖維素上，并且纖維素酶的吸附力與相關(guān)水解活力沒有線性關(guān)系[25]，纖維素酶在烘干溫度為50 ℃條件下的活性最高，這一結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道一致[26]。這可能是因?yàn)闇囟鹊奶岣呓档土死w維素酶對(duì)于秸稈的吸附力，也有可能是因?yàn)闇囟鹊奶岣咂茐牧思?xì)胞的結(jié)構(gòu)，使得纖維素酶釋放出來，對(duì)于纖維素酶吸附機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

對(duì)于真菌孢子的保存一般采用低溫烘干保存法，并且低溫烘干后可以保存數(shù)月之久[27]。在烘干溫度為40 ℃時(shí)孢子存活數(shù)最高，考慮到含水量高使得孢子代謝旺盛，更容易導(dǎo)致孢子死亡，因此本實(shí)驗(yàn)建議在40 ℃的溫度下烘干后，低溫保存，可以減少孢子的損耗。

根據(jù)以上結(jié)果，考慮到實(shí)際生產(chǎn)中的秸稈分解效率和成本，以對(duì)秸稈降解起主要作用的纖維素酶為基準(zhǔn)，綜合考慮木聚糖酶和淀粉酶的相對(duì)最適條件，可選定硫色曲霉SQ-3培養(yǎng)的相對(duì)最適條件(即：培養(yǎng)時(shí)間為3 d，培養(yǎng)溫度為28 ℃，初始pH為7.0；固體發(fā)酵配方：玉米秸稈粉為25.7%，豆粕為5.8%，麥麩為8.5%，1% NaNO3溶液為60%)。在此條件下培養(yǎng)，纖維素酶活性為453.3 U·g-1，淀粉酶活性為3.9×103U·g-1，木聚糖酶活性為1.48×105U·g-1。對(duì)發(fā)酵料進(jìn)行烘干時(shí)，宜選用低溫(40 ℃)烘干，以最大限度保存3種酶的活性和孢子活性。相關(guān)結(jié)果可為秸稈的回收利用、木聚糖酶和纖維素酶工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的數(shù)據(jù)。