黎 成，卜 超，蘇 赟，鐘嘉寶，潘愛珍，高明勇，黃穗喬*

(1.佛山市第一人民醫(yī)院放射科，廣東 佛山 528000；2.中山大學(xué)附屬孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院放射科，廣東 廣州 510120；3.佛山市南海區(qū)第五人民醫(yī)院內(nèi)科，廣東 佛山 528200)

放射性腦損傷(radiation-induced brain injury， RBI)是頭頸部惡性腫瘤經(jīng)放射治療后出現(xiàn)的嚴(yán)重臨床并發(fā)癥之一，在放射治療患者中發(fā)病率約1.9%～2.5%[1]，嚴(yán)重影響其生存質(zhì)量及預(yù)后[2]，但放射治療仍是部分頭頸部惡性腫瘤的首選治療手段，使早期診斷及治療RBI成為亟待解決的問題。目前診斷RBI主要依靠臨床病史及影像學(xué)檢查。近年來，fMRI技術(shù)和PET的發(fā)展及應(yīng)用提高了RBI的早期檢出率及診斷準(zhǔn)確率，但是其圖像空間分辨率低，缺乏特異性[3-5]。本課題組在前期研究[6]中應(yīng)用細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1， ICAM-1)抗體鏈接熒光標(biāo)記的微米級(jí)氧化鐵顆粒(microparticles of iron oxide， MPIO)，合成單靶向分子示蹤劑ICAM-MPIO，發(fā)現(xiàn)對(duì)早期診斷RBI有一定應(yīng)用價(jià)值。在此基礎(chǔ)上，本研究利用ICAM-1抗體、血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1， VCAM-1)抗體及MPIO制備MRI單靶向分子示蹤劑ICAM-MPIO、VCAM-MPIO及雙靶向分子示蹤劑細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecule， CAM)-MPIO，評(píng)估其與體外細(xì)胞結(jié)合的特異性及效率，為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及靶向藥物研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926(武漢普諾賽生命科技有限公司)；MPIO(Bangs Lab，1毫升/支，質(zhì)量濃度10 mg/ml，粒徑0.50～2.00 μm(平均約1.63 μm，鐵含量約42.5%)；小鼠抗人ICAM-1/VCAM-1單克隆抗體及相應(yīng)的二抗、DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole， 4',6-二脒基-2-苯基吲哚)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α， TNF-α；R&D System)；瓊脂糖(上海碧云天生物科技有限公司)；2-嗎啉乙磺酸(Sigma)；磁珠分選儀(Invitrogen)；CO2培養(yǎng)箱(HeraeusBB16)；倒置相差顯微鏡(Nikon)；激光共聚焦顯微鏡(Zeiss)。

1.2 制備 MRI靶向分子示蹤劑ICAM-MPIO、VCAM-MPIO及CAM-MPIO 加入2-嗎啉乙磺酸激活MPIO微球表面的羧基基團(tuán)，再分別加入小鼠抗人ICAM-1、VCAM-1單克隆抗體(制備ICAM-MPIO、VCAM-MPIO)，或同時(shí)加入小鼠抗人ICAM-1和VCAM-1單克隆抗體(制備CAM-MPIO)，37℃下不斷旋轉(zhuǎn)孵育20 h，待其充分反應(yīng)后加入終止反應(yīng)液。采用磁珠分選儀收集MPIO，棄去上清液，加入pH=7.4的PBS緩沖液(含0.5%牛血清白蛋白和0.05%吐溫20)充分阻斷未反應(yīng)的活性羧基位點(diǎn)，最后用儲(chǔ)存液重懸并4℃條件下保存。以上所有操作均在避光條件下完成。

1.3 TNF-α激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表面ICAM-1及VCAM-1抗體表達(dá)情況 將不同濃度(1、5、10、20、50 ng/ml)TNF-α加入人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中(實(shí)驗(yàn)組)，對(duì)照組則加入等量PBS緩沖液；以Western-Blot法檢測(cè)細(xì)胞表面ICAM-1及VCAM-1抗體的表達(dá)，計(jì)算ICAM-1和VCAM-1與內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase， GAPDH)的相對(duì)表達(dá)量。免疫熒光實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞加入10 ng/ml的TNF-α，對(duì)照組則加入等量PBS緩沖液，均分別加入ICAM-1、VCAM-1抗體及相應(yīng)的二抗，用DAPI將細(xì)胞核染成藍(lán)色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞核周圍綠色熒光、紅色熒光分布情況。

1.4 靶向分子示蹤劑與體外細(xì)胞特異性結(jié)合普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn) 將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組(TNF-α激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后分別與CAM-MPIO、VCAM-MPIO、ICAM-MPIO共同孵育)，對(duì)照組(無TNF-α+CAM-MPIO)及競(jìng)爭抑制組(TNF-α+足量的游離ICAM-1及VCAM-1抗體+CAM-MPIO，以阻斷細(xì)胞表面ICAM-1及VCAM-1抗體的結(jié)合位點(diǎn))。實(shí)驗(yàn)組及競(jìng)爭抑制組細(xì)胞用濃度為10 ng/ml的TNF-α刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)照組則加入等量PBS緩沖液，與相應(yīng)靶向分子示蹤劑充分結(jié)合后，進(jìn)行普魯士藍(lán)染色，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞表面鐵染色情況。

1.5 靶向分子示蹤劑與體外細(xì)胞特異性結(jié)合免疫熒光實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分組同1.4，實(shí)驗(yàn)組及競(jìng)爭抑制組細(xì)胞用濃度為20 ng/ml的TNF-α刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)照組則加入等量PBS緩沖液，與相應(yīng)靶向分子示蹤劑充分結(jié)合后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞周圍黃色熒光分布情況。利用Image J軟件(V1.8.0)測(cè)量各組細(xì)胞周圍黃色熒光面積。

1.6 靶向分子示蹤劑與體外細(xì)胞特異性結(jié)合MR掃描 實(shí)驗(yàn)分組同1.4，實(shí)驗(yàn)組及競(jìng)爭抑制組用濃度為10 ng/ml的TNF-α刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)照組則加入等量PBS緩沖液，與不同濃度(0、0.1、1、2、5、10 μg/ml)的靶向分子示蹤劑充分結(jié)合，然后用2%瓊脂糖溶液(使用時(shí)加熱至液態(tài))重懸，充分冷卻后進(jìn)行MR掃描。

采用Philips Gvroscar Intera 1.5T MR掃描儀，掃描序列包括FSE序列T2WI及T2-mapping。T2WI：TR 2 000 ms，TE 100 ms，F(xiàn)OV 80 mm×80 mm，矩陣256×256，層厚2 mm；T2-mapping：TR 2 000 ms，TE 20 ms，F(xiàn)OV 80 mm×80 mm，矩陣256×256，層厚1.5 mm。采用Image J軟件處理T2-mapping圖像，觀察T2WI和T2-mapping偽彩圖。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表面ICAM-1及VCAM-1抗體表達(dá)情況 經(jīng)Western-Blot實(shí)驗(yàn)獲取各組條帶及分析灰度值，ICAM-1/GAPDH和VCAM-1/GAPDH相對(duì)表達(dá)量先隨TNF-α濃度增高而增高，TNF-α濃度為10 ng/ml時(shí)相對(duì)表達(dá)量最高，分別為對(duì)照組(濃度為0)的(2.38±0.71)倍和(2.67±0.67)倍，之后隨濃度升高而有所下降，見表1、圖1。

表1 實(shí)驗(yàn)組不同濃度TNF-α刺激內(nèi)皮細(xì)胞表面和對(duì)照組的VCAM-1及ICAM-1相對(duì)表達(dá)量(±s)

注：*：與對(duì)照組比較，P<0.05

圖1 不同濃度TNF-α刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表面ICAM-1及VCAM-1表達(dá)Western-Blot條帶圖

激光共聚焦顯微鏡下觀察，實(shí)驗(yàn)組視野內(nèi)藍(lán)色熒光的細(xì)胞核周圍可見彌漫分布不同強(qiáng)度的綠色熒光或紅色熒光，而對(duì)照組視野內(nèi)藍(lán)色熒光的細(xì)胞核周圍僅見散在分布的點(diǎn)狀綠色熒光或紅色熒光(圖2)，實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度均明顯強(qiáng)于對(duì)照組。

2.2 靶向分子示蹤劑與體外細(xì)胞特異性結(jié)合普魯士藍(lán)染色結(jié)果 倒置相差顯微鏡下觀察，MPIO微球中的鐵顆粒被普魯士藍(lán)染液染成藍(lán)色，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表面見大量散在分布點(diǎn)狀藍(lán)染鐵顆粒，且CAM-MPIO組藍(lán)染鐵顆粒分布較ICAM-MPIO組、VCAM-MPIO組明顯增多，而對(duì)照組、競(jìng)爭抑制組細(xì)胞周圍僅見散在少量點(diǎn)狀藍(lán)染鐵顆粒分布，見圖3。

2.3 靶向分子示蹤劑與體外細(xì)胞特異性結(jié)合免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果 激光共聚焦顯微鏡下觀察，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞周圍見明顯點(diǎn)狀、斑片狀黃色熒光，而對(duì)照組及競(jìng)爭抑制組細(xì)胞周圍幾乎未見明確黃色熒光分布，見圖4。各組間細(xì)胞周圍黃色熒光面積總體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=201.57，P<0.01)，對(duì)照組與競(jìng)爭抑制組、ICAM-MPIO組與VCAM-MPIO組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.98、0.56)，余組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，見圖5。CAM-MPIO組的細(xì)胞周圍黃色熒光面積分別為ICAM-MPIO、VCAM-MPIO組的(2.00±0.31)倍和(2.46±0.45)倍。

2.4 靶向分子示蹤劑與體外細(xì)胞特異性結(jié)合MRI結(jié)果 3個(gè)實(shí)驗(yàn)組T2WI信號(hào)強(qiáng)度和T2值隨靶向分子示蹤劑濃度增高呈不同程度減低，以CAM-MPIO組減低為著；競(jìng)爭抑制組及對(duì)照組T2WI信號(hào)強(qiáng)度及T2值略有減低；見圖6、7。

3 討論

RBI早期病理生理表現(xiàn)為照射野內(nèi)腦組織的炎癥過程，主要為小膠質(zhì)細(xì)胞激活，釋放大量促炎癥因子如白介素-1β、白介素-6、TNF-α，環(huán)氧合酶-2等，促炎因子、細(xì)胞因子分泌，介導(dǎo)炎癥細(xì)胞穿過內(nèi)皮細(xì)胞間隙到達(dá)組織發(fā)揮作用，損傷腦組織[7]。在眾多細(xì)胞因子中，ICAM-1、VCAM-1發(fā)揮重要作用，研究[8-9]表明，在射線誘導(dǎo)下，ICAM-1、VCAM-1表達(dá)明顯上調(diào)，從而介導(dǎo)炎性損傷過程。本研究以TNF-α代替射線，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生炎性損傷，結(jié)果顯示在TNF-α刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞表面ICAM-1及VCAM-1表達(dá)明顯上調(diào)，且呈濃度依賴性，與既往研究[6]結(jié)果一致，提示ICAM-1及VCAM-1可作為識(shí)別血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥損傷的靶點(diǎn)，有望早期發(fā)現(xiàn)以此為病理基礎(chǔ)的病變?nèi)鏡BI等。

圖2 TNF-α刺激人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn) A、B.ICAM-1表達(dá),對(duì)照組(A)細(xì)胞核周圍見散在少量綠色熒光，實(shí)驗(yàn)組(B)細(xì)胞核周圍見大量綠色熒光； C、D.VCAM-1表達(dá),對(duì)照組(C)細(xì)胞核周圍見散在斑點(diǎn)狀紅色熒光，實(shí)驗(yàn)組(D)細(xì)胞核周圍見大量紅色熒光

圖3普魯士藍(lán)染色顯示靶向分子示蹤劑與體外細(xì)胞特異性結(jié)合情況 A～C.分別為CAM-MPIO組、VCAM-MPIO組和ICAM-MPIO組，均可見大量藍(lán)染的鐵顆粒位于細(xì)胞膜上，CAM-MPIO組最多； D、E.分別為競(jìng)爭抑制組和對(duì)照組，均可見散在少量藍(lán)染的鐵顆粒

MPIO作為靶向分子示蹤劑載體，與ICAM-1或VCAM-1結(jié)合，已廣泛應(yīng)用于分子MRI研究。Deddens等[10]觀察小鼠腦卒中模型，發(fā)現(xiàn)ICAM-MPIO的腦血管炎癥分子成像效果優(yōu)于脂質(zhì)體標(biāo)記的釓對(duì)比劑；而McAteer等[11-12]發(fā)現(xiàn)雙靶向分子示蹤劑較單靶向分子示蹤劑更有助于動(dòng)脈硬化斑塊的成像及活動(dòng)性評(píng)估。

本研究采用化學(xué)縮合方法成功制備雙靶向分子示蹤劑CAM-MPIO及單靶向分子示蹤劑ICAM-MPIO、VCAM-MPIO。在靶向分子示蹤劑與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)普魯士藍(lán)染色發(fā)現(xiàn)TNF-α激活的內(nèi)皮細(xì)胞周圍分布大量藍(lán)染MPIO微球，免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)被激活內(nèi)皮細(xì)胞表面分布大量帶黃色熒光的MPIO微球，T2WI信號(hào)強(qiáng)度及T2值隨靶向分子示蹤劑濃度增加而減低，表明合成的靶向分子示蹤劑均可特異性地與被激活的內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合，既可進(jìn)行光學(xué)成像，又可進(jìn)行MR成像。比較免疫熒光實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞周圍的黃色熒光面積，CAM-MPIO組熒光面積明顯大于ICAM-MPIO、VCAM-MPIO組，提示雙靶向分子示蹤劑與內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)合數(shù)量多于單靶向分子示蹤劑，間接反映雙靶向分子示蹤劑與內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)合效果優(yōu)于單靶向分子示蹤劑，為下一步應(yīng)用上述合成的雙靶向分子示蹤劑進(jìn)行小鼠RBI模型無創(chuàng)性早期影像學(xué)診斷研究提供了理論基礎(chǔ)。

圖4免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示靶向分子示蹤劑與體外細(xì)胞特異性結(jié)合情況 A～C.分別為CAM-MPIO組、ICAM-MPIO組和VCAM-MPIO組，細(xì)胞周圍均見大量黃色熒光分布； D、E.分別為競(jìng)爭抑制組和對(duì)照組，細(xì)胞周圍幾乎未見明確黃色熒光分布

圖5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示靶向分子示蹤劑與體外細(xì)胞特異性結(jié)合黃色熒光面積柱圖 (*：與CAM-MPIO組比較，P<0.01)

本研究的主要不足在于MPIO表面由惰性材料包被，在人體內(nèi)不能被生物降解，至今尚未被食品藥品監(jiān)督管理局(food and drug administration, FDA)批準(zhǔn)用于人體研究，僅可用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或離體實(shí)驗(yàn)。目前已可利用FDA批準(zhǔn)的可作為藥物載體的乳酸羥基乙酸共聚物(polylactide-co-glycolide， PLGA)和生物素包被MPIO成功合成靶向分子示蹤劑[13-14]，但尚未見應(yīng)用于人體的研究。相信在不久的將來會(huì)找到可生物降解的材料包被MPIO合成靶向示蹤劑或作為靶向藥物載體用于人類，協(xié)助早期診斷及靶向治療疾病。

圖6 T2WI示靶向分子示蹤劑與體外細(xì)胞特異性結(jié)合情況 圖7 T2-mapping偽彩圖示靶向分子示蹤劑與體外細(xì)胞特異性結(jié)合情況