陳慧菁, 廖錦容, 李潔羽, 葉韻斌

(福建省腫瘤醫(yī)院， 福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤免疫學(xué)研究室, 福建省腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350014)

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率已經(jīng)位居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率的第5位，近年來，結(jié)直腸癌的發(fā)病率趨向年輕化，發(fā)病有明顯的性別差異性，青年女性的發(fā)病率低于同年齡段的男性，而女性絕經(jīng)期后結(jié)直腸癌的發(fā)病率明顯上升，略高于同年齡段的男性[1]。有不少相關(guān)報(bào)道表明雌激素可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。

7-羥基異黃酮(7-hydroxyisoflavone，7-HIF)是一種植物類雌激素，為大豆異黃酮的代謝產(chǎn)物，與大豆異黃酮的主要成分3-羥基異黃酮結(jié)構(gòu)類似。研究表明3-羥基異黃酮對(duì)于乳腺癌和黑色素瘤等多種腫瘤具有抗腫瘤作用[2-3]，其主要的作用機(jī)制包括抑制腫瘤細(xì)胞血管生成及蛋白酪氨酸激酶活性、誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[4]等。但關(guān)于7-HIF是否具有抗腫瘤作用目前鮮有報(bào)道，7-HIF對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制目前仍不清楚。

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells，CSCs) 是腫瘤組織中存在的、為數(shù)不多的具有自我更新能力、多分化潛能和無限增殖的細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。分化抑制因子1(inhibitor of differentiation 1，Id1)是分化抑制因子家族成員，屬于螺旋-環(huán)-螺旋(helix-loop-helix，HLH)轉(zhuǎn)錄因子。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究發(fā)現(xiàn)沉默人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116中的Id1基因后細(xì)胞中干性相關(guān)分子的mRNA和蛋白表達(dá)水平均下降，提示Id1能夠與結(jié)直腸癌細(xì)胞的干性特征相關(guān)[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道3-羥基異黃酮通過抑制Notch1/NF-κB/Slug/E-cadherin信號(hào)通路能逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞干性，因此可作為潛在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物[6]。與其結(jié)構(gòu)相似的7-HIF是否也能通過Id1調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞的干性影響其生長(zhǎng)? 因此本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察7-HIF對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的影響，并初步研究7-HIF是否通過Id1影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性。

材 料 和 方 法

1 試劑

7-HIF系福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)系陳翔飛博士惠贈(zèng);RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶均購自Gibco；Western blot裂解液和定量相關(guān)試劑購自碧云天生物試劑公司；WST-1試劑盒購自Roche；凋亡及細(xì)胞周期檢測(cè)相關(guān)試劑購自BD；Anti-rabbit IgG HRP-linked antibody和抗GAPDH抗體購自Cell Signaling；抗Id1抗體購自Santa Cruz；抗細(xì)胞周期蛋白(cyclin) D1、cyclin E、survivin、增殖細(xì)胞核抗原(prolife rating cell nuclear antigen, PCNA)、CD133、白細(xì)胞活化黏附因子(activated leukocyte cell adhesion molecule, ALCAM)和上皮細(xì)胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)抗體均購自Abcam。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116購自上海細(xì)胞庫，用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 WST-1法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT116細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞個(gè)數(shù)至每孔5×103，接種到96孔板，每孔做3個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12 h, 分別加入 0 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L和400 μmol/L的7-HIF繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)液，加入10 μL WST-1工作液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)490 nm處吸光度(A)值。

2.3 集落形成實(shí)驗(yàn) 胰酶消化后的HCT116細(xì)胞，按每孔1 500個(gè)細(xì)胞(2 mL)接種到6孔板中，24 h后換液加入200 μmol/L 7-HIF，每隔3～4 d補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)液，10 d后棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染液染色，顯微鏡下觀察超過50個(gè)細(xì)胞為1個(gè)克隆，計(jì)算集落數(shù)。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 HCT116細(xì)胞消化后調(diào)整密度至4×108/L，接種于6孔板，5%CO2培養(yǎng)18 h貼壁后, 同步化處理(無血清培養(yǎng) 24 h)后，換液加入含 10%FBS 的培養(yǎng)液及200 μmol/L的7-HIF培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞，PBS洗滌后按試劑盒說明書分別依次加入相應(yīng)的細(xì)胞周期相關(guān)試劑，避光孵育10 min，用50 μm的尼龍膜過濾，上機(jī)檢測(cè)。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 HCT116細(xì)胞按2.4操作，PBS洗滌后加入Binding Buffer 重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC混勻后，再加入PI，避光室溫孵育10 min, 用50 μm的尼龍膜過濾，上機(jī)檢測(cè)。

2.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞，加入裂解液提取蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，40 μg總蛋白等量上樣，10%SDS-PAGE分離蛋白，濕法轉(zhuǎn)至 PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h， I 抗用5%脫脂奶粉11 000稀釋，4 ℃孵育過夜， 用 緩沖液TBST漂3次，然后加入 II 抗室溫下孵育1 h，熒光發(fā)光試劑顯影后使用圖像成像系統(tǒng)檢測(cè)條帶。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 7-HIF抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116活力

WST-1法檢測(cè)細(xì)胞的活力，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，藥物濃度為200 μmol/L和400 μmol/L時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制(P<0.05),見圖1。

Figure 1. WST-1 assay was used to measure the cell viability after exposure to 7-HIF. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1 不同濃度的7-HIF對(duì)HCT116細(xì)胞活力的影響

2 7-HIF抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116克隆形成

從生長(zhǎng)曲線可知當(dāng)藥物濃度為200 μmol/L時(shí)，HCT116細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中我們均采用200 μmol/L的濃度。集落形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證7-HIF對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示7-HIF作用10 d 后的HCT116細(xì)胞的集落形成的數(shù)目及大小均較未處理組明顯減少(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The colony formation ability of HCT116 cells after exposure to 200 μmol/L 7-HIF. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖2 集落形成實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證7-HIF對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響

3 7-HIF對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116細(xì)胞周期的影響

結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，200 μmol/L 7-HIF處理后的HCT116細(xì)胞周期G0/G1期的比例顯著升高(P<0.05)，而S期的比例顯著下降(P<0.05)，提示7-HIF能使HCT116細(xì)胞阻滯于G0/G1期，從而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，見圖3A。7-HIF處理后細(xì)胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E、凋亡抑制因子survivin和PCNA表達(dá)較對(duì)照組均明顯下降(P<0.05)，見圖3B。提示7-HIF可能是通過抑制HCT116細(xì)胞周期相關(guān)蛋白和增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)從而抑制了細(xì)胞的增殖。

Figure 3. 7-HIF induced cell cycle arrest at G0/G1phase and blocked the expression of proliferation-related protein in the HCT116 cells. A: HCT116 cells were treated with 7-HIF at 200 μmol/L for 24 h and the cell cycle distribution was analyzed by flow cytometry; B: the effect of 7-HIF on the expression of proliferation-related proteins in the HCT116 cells determined was by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 7-HIF對(duì)HCT116細(xì)胞周期及相關(guān)增殖蛋白的影響

4 7-HIF誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)7-HIF(200 μmol/L)處理48 h后的HCT116細(xì)胞的凋亡率顯示：7-HIF處理組的HCT116細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組明顯增高(P<0.05)，見圖4。

5 7-HIF影響HCT116細(xì)胞干性相關(guān)蛋白的表達(dá)

7-HIF處理后HCT116細(xì)胞干性相關(guān)蛋白CD133、ALCAM和EpCAM的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(P<0.05),見圖5。提示7-HIF能抑制HCT116細(xì)胞的干性。

6 7-HIF下調(diào)HCT116細(xì)胞中Id1的表達(dá)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予200 μmol/L 7-HIF處理48 h后，HCT116細(xì)胞中Id1的蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組降低(P<0.05)，見圖6。表明7-HIF能抑制HCT116細(xì)胞中Id1的表達(dá)。

Figure 4. The effect of 7-HIF on the apoptosis of HCT116 cells was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 7-HIF對(duì)HCT116細(xì)胞凋亡的影響

Figure 5. The effect of 7-HIF on the expression of stemness related proteins in the HCT116 cells was detected by Western blot. GAPDH served as an internal control. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖5 Western blot法檢測(cè)7-HIF對(duì)HCT116細(xì)胞干性相關(guān)蛋白的影響

討 論

研究表明，雌激素與大腸癌存在密切關(guān)系，上個(gè)世紀(jì)70年代流行病學(xué)研究表明，大腸癌與乳腺癌具有相似的流行病學(xué)特點(diǎn)，提示雌激素可能是大腸癌的致病因素之一[7]。隨著研究的深入，關(guān)于雌激素究竟具有促進(jìn)腫瘤還是抑制腫瘤的作用仍然存在爭(zhēng)議。流行病學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，在一些經(jīng)常食用大豆的國(guó)家里，結(jié)腸癌的發(fā)病率較低[8];Meta分析顯示，大豆異黃酮的攝入能顯著的降低女性大腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[9];另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，年齡大于56歲的婦女使用雌激素，結(jié)直腸腸癌的發(fā)病率比未使用者明顯降低，提示適量雌激素可能抑制結(jié)直腸癌腫瘤的生長(zhǎng)[10]。

大豆異黃酮是目前應(yīng)用最廣的植物雌激素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素類似，3-羥基異黃酮是其中最主要的有效成分。研究證實(shí)，3-羥基異黃酮能活化雌激素受體β,通過雌激素受體β選擇性激活促凋亡信號(hào)發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，抑制炎癥腫瘤微環(huán)境的信號(hào)[11]。雌激素受體β在大腸組織中可能發(fā)揮抑癌基因作用，在防止大腸黏膜細(xì)胞惡變，抑制癌細(xì)胞增殖的同時(shí)促進(jìn)腸癌細(xì)胞凋亡[12]。7-HIF作為大豆異黃酮的代謝產(chǎn)物，與3-羥基異黃酮結(jié)構(gòu)類似，在研究中我們發(fā)現(xiàn)7-HIF能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116的生長(zhǎng)，使其細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示7-HIF能降低細(xì)胞周期蛋白cyclin D1和cyclin E的表達(dá)，同時(shí)能降低增殖相關(guān)蛋白survivin和PCNA的表達(dá)，提示7-羥基異黃酮通過抑制細(xì)胞周期蛋白及增殖相關(guān)的表達(dá)而使腸癌細(xì)胞處于靜止的狀態(tài)，從而抑制腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。由于腫瘤發(fā)生是腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡平衡失調(diào)的結(jié)果，進(jìn)一步的凋亡研究表明7-HIF作用后能使腸癌細(xì)胞的凋亡率明顯上升，提示7-HIF可能通過抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和促進(jìn)其凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的主要原因。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源。腫瘤干細(xì)胞具有自我更新能力，無限增殖的潛能，增強(qiáng)侵襲和轉(zhuǎn)移能力[13]、抗常規(guī)放療和化療的能力，這些可能是腫瘤治療失敗的主要原因[14]。鑒定腫瘤干細(xì)胞最權(quán)威的方法之一是篩選確定腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞表面標(biāo)志物。目前比較確定的結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物主要有EpCAM、ALCAM、CD133、CD44、CD24和CD166等[15]。Id1是分化抑制因子家族成員，其生物學(xué)功能是對(duì)抗分化轉(zhuǎn)錄因子而讓細(xì)胞停留在未分化的狀態(tài)，具有維持其自我更新的功能。研究發(fā)現(xiàn)雌激素能影響Id1的表達(dá)，Schoppmann 等[16]在191例乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)Id1的高表達(dá)與孕激素受體的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān),提示激素療法可能會(huì)影響Id1的表達(dá);Jang等[17]對(duì)263例乳腺癌組織標(biāo)本分析發(fā)現(xiàn)Id1高表達(dá)與雌激素受體陰性和結(jié)節(jié)型乳腺癌以及微血管密度明顯相關(guān)，這些均提示在乳腺癌中雌激素能影響Id1的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也發(fā)現(xiàn)在HCT116細(xì)胞中Id1呈高表達(dá)狀態(tài)，小干擾RNA沉默Id1后其增殖活性和克隆形成能力明顯下降，結(jié)直腸癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD24、CD44、CD133、CD166和EpCAM的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯下降[5]，提示在結(jié)直腸癌中Id1的表達(dá)與腫瘤的增殖、干性密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示7-HIF能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，促進(jìn)其凋亡。7-HIF作用于HCT116細(xì)胞能降低Id1蛋白表達(dá)的水平，同時(shí)7-HIF能明顯降低結(jié)腸癌細(xì)胞干性相關(guān)標(biāo)志物CD133、ALCAM和EpCAM的表達(dá)，提示7-HIF可能是通過下調(diào)Id1影響了HCT116細(xì)胞的干性，從而影響了HCT116細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。

Figure 6. The protein expression of Id1 was reduced by treating with 200 μmol/L 7-HIF. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖6 7-HIF對(duì)HCT116細(xì)胞Id1表達(dá)的影響