王 遠(yuǎn), 何主強(qiáng), 羅 明, 黃從剛, 宋 平, 王孟陽(yáng), 段發(fā)亮

(武漢市第一醫(yī)院神經(jīng)外科, 湖北 武漢 430022)

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)是一類(lèi)具有高致殘率和致死率的疾病，TBI之后的繼發(fā)性腦損傷引起的神經(jīng)炎癥及氧自由基等可促進(jìn)caspase依賴(lài)的細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致大量神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，最后引起神經(jīng)功能?chē)?yán)重受損[1-3]，因此，減少凋亡所引起的細(xì)胞死亡及功能障礙，促進(jìn)損傷神經(jīng)元的再生增殖，是目前TBI研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。突觸后膜骨架蛋白Homer1a是一種存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，參與調(diào)控抑郁癥和癲癇等多種神經(jīng)性疾病的發(fā)生和發(fā)展，是目前研究最為廣泛的Homer蛋白[4-6]。研究表明，神經(jīng)損傷后Homer1a蛋白表達(dá)量會(huì)發(fā)生特異性變化，是一種反映神經(jīng)損傷的新型敏感指標(biāo)[7]。AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一種主要由神經(jīng)元合成的絲氨酸/蘇氨酸激酶，細(xì)胞能量代謝發(fā)生障礙可激活A(yù)MPK磷酸化，磷酸化的AMPK可通過(guò)介導(dǎo)多條信號(hào)通路參與神經(jīng)元修復(fù)過(guò)程[8-10]。但Homer1a如何通過(guò)磷酸化的AMPK對(duì)機(jī)械性損傷的神經(jīng)元細(xì)胞起到保護(hù)作用，其機(jī)制目前尚不明確。因此，本研究擬通過(guò)體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元，構(gòu)建神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型，并采用基因編輯技術(shù)過(guò)表達(dá)Homer1a蛋白水平，初步探討過(guò)表達(dá)Homer1a蛋白對(duì)神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型的保護(hù)作用及其對(duì)AMPK蛋白表達(dá)的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

清潔級(jí)Sprague-Dawley (SD)大鼠，雌性，孕16～17 d，由湖北省疾控中心提供,合格證號(hào)No.42000600029456；皮層神經(jīng)元從胎鼠大腦皮層提取。DMEM培養(yǎng)液和Neurobasal培養(yǎng)液(Gibco)；兔單克隆Homer1a抗體、兔多克隆cleaved caspase-3抗體、兔單克隆Bax抗體、兔單克隆Bcl-2抗體、兔單克隆AMPKα抗體和兔單克隆磷酸化AMPKα(p-AMPKα)抗體(Abcam)；兔多克隆GAPDH抗體和小鼠抗兔IgG抗體(Bioswamp)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen)；SYBR Green PCR試劑盒(KAPA Biosystems)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和RIPA蛋白裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

2 方法

2.1 大鼠腦皮層神經(jīng)元的分離培養(yǎng) 取孕16～17 d SD大鼠，常規(guī)消毒后腹腔注射戊巴比妥鈉(120 mg/kg)進(jìn)行麻醉后，暴露腹腔，快速取出大鼠子宮置于無(wú)菌臺(tái)上消毒過(guò)的培養(yǎng)皿中，分離胎鼠大腦皮層，吸入于預(yù)冷的PBS中，仔細(xì)去除腦皮層表面腦膜及細(xì)小血管組織，PBS清洗1遍后，將腦皮質(zhì)小心剪碎，逐滴緩慢加入預(yù)熱至室溫的0.1%胰蛋白酶，置于37 ℃培養(yǎng)箱中消化20 min。隨后將消化后的組織塊轉(zhuǎn)移到含有10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，小心多次吹打細(xì)胞成勻漿后離心，去掉上清液，使用含F(xiàn)BS的DMEM重懸細(xì)胞沉淀，顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度，將5×108/L細(xì)胞接種至鋪有多聚賴(lài)氨酸的培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后棄去培養(yǎng)液，小心洗滌細(xì)胞后，用含有10% B27的Neurobasal培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞，每3 d半量換液。培養(yǎng)6～8 d，經(jīng)細(xì)胞鑒定成功后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 離體神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型的建立 取10 μL的微量移液器塑料槍頭在培養(yǎng)皿內(nèi)劃割神經(jīng)元，橫豎各劃8道，劃傷道寬度約為1 mm，標(biāo)記線均勻分布在培養(yǎng)皿表面，造成神經(jīng)元機(jī)械性損傷[11]，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色及LDH含量測(cè)定，以保證同一組內(nèi)神經(jīng)元損傷程度和范圍一致。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 待神經(jīng)元培養(yǎng)成功后，以每孔5×104的密度將神經(jīng)元接種至24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)70%左右時(shí)，采用Homer1a過(guò)表達(dá)慢病毒載體(pLVX-IRES-ZsGreen1-expHomer1a，購(gòu)于上海漢恒生物科技有限公司，下文記作Exp-Homer1a)及相應(yīng)的空載體按照感染復(fù)數(shù)為20進(jìn)行細(xì)胞感染，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h備用。本實(shí)驗(yàn)分為4組，分別為對(duì)照(control)組、模型(model)組、空載(empty vector)組和Exp-Homer1a組。對(duì)照組為正常神經(jīng)元;模型組按照上述方法構(gòu)建神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型;空載組和Exp-Homer1a組是在神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型中轉(zhuǎn)載空載體和Homer1a過(guò)表達(dá)慢病毒載體。

2.4 qPCR檢測(cè)Hormer1a mRNA表達(dá)水平 收集各組細(xì)胞沉淀，TRIzol法提取各組神經(jīng)元總RNA，根據(jù)M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后以cDNA作為模板，采用SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增反應(yīng)。Hormer1a上游引物序列為5’-CACCCGATGTGACACAGAACTC-3’，下游引物序列為5’-TGATTGCTGAATTGAATGTGTACCT-3’。GAPDH上游引物序列為5’-CAAGTTCAACGGCACAG-3’，下游引物序列為5’-CCAGTAGACTCCACGACAT-3’。以GAPDH作為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算各組之間Hormer1a的表達(dá)差異。

2.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 將各組細(xì)胞置于96孔板內(nèi)，每孔加入終濃度為0.5 g/L MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心吸出培養(yǎng)液，每孔加入750 μL DMSO，低速震蕩搖床中混勻10 min，然后取出150 μL溶液置于96孔板內(nèi)，采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處光吸光度(A)，計(jì)算各組細(xì)胞相對(duì)活力，細(xì)胞相對(duì)活力(%)=(A實(shí)驗(yàn)組-A空白組)/(A對(duì)照組-A空白組)×100%。

2.6 LDH活性檢測(cè) 各組細(xì)胞處理結(jié)束后，留取各組培養(yǎng)液上清，依據(jù)LDH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH活性。

2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡 收集各組細(xì)胞的培養(yǎng)液上清，采用0.2%胰蛋白酶(不含EDTA)消化處理制備單細(xì)胞懸液，與培養(yǎng)液上清一起收集至15 mL離心管內(nèi)。200×g室溫離心5 min，去除上清，采用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，棄去上清。加入適量Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，各取100 μL細(xì)胞懸液置于1.5 mL離心管中，依次加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染液，設(shè)置單染管和雙染管，輕輕混勻后置于25℃水浴中避光孵育15 min。然后加入適量Annexin V-FITC結(jié)合液，混勻后置于冰上終止反應(yīng)。直接采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光信號(hào)。

2.8 Western blot檢測(cè)Hormer1a、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2和p-AMPK蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞沉淀，加入適量RIPA蛋白裂解液提取神經(jīng)元總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣20 μg蛋白，經(jīng)12% SDS-PAGE后，采用濕轉(zhuǎn)法將分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于5%脫脂牛奶(TBST配制)中室溫封閉1.5 h；TBST洗膜后將膜放入自封袋中，分別加入抗Homer1a、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2、p-AMPK、AMPK以及GAPDH抗體的稀釋液，于4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次后加入小鼠抗兔IgG抗體稀釋液，室溫孵育1.5 h。TBST洗膜3次，HRP顯色液顯色，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光分析儀檢測(cè)。使用ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，將目的蛋白灰度值與GAPDH蛋白灰度值的比值以及p-AMPK蛋白灰度值與AMPK蛋白灰度值的比值作為各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組神經(jīng)元Homer1a表達(dá)

采用qPCR和Western blot分別檢測(cè)各組神經(jīng)元中Homer1a的表達(dá)，結(jié)果顯示，模型組神經(jīng)元中Homer1a的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組神經(jīng)元(P<0.05)；Exp-Homer1a組神經(jīng)元中Homer1a的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于模型組和空載組神經(jīng)元(P<0.05)，見(jiàn)圖1、2，表明神經(jīng)元轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)Homer1a載體成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

Figure 1. Relative protein expression of Homer1a was determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖1 各組神經(jīng)元Homer1a的蛋白表達(dá)

2 過(guò)表達(dá)Homer1a可提高機(jī)械性損傷神經(jīng)元的活力

過(guò)表達(dá)Homer1a后，MTT檢測(cè)各組細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組神經(jīng)元活力顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，Exp-Homer1a組神經(jīng)元活力顯著升高(P<0.05)，空載組與模型組神經(jīng)元活力之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

3 過(guò)表達(dá)Homer1a可降低機(jī)械性損傷神經(jīng)元上清液的LDH活性

LDH活性檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組LDH活性顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，Exp-Homer1a組LDH活性明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 2. Relative mRNA expression of Homer1a was detected by qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖2 各組神經(jīng)元Homer1a的mRNA表達(dá)

Figure 3. The neuronal viability was detected by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖3 MTT檢測(cè)各組神經(jīng)元活力

4 過(guò)表達(dá)Homer1a可降低機(jī)械性損傷神經(jīng)元的凋亡率

在神經(jīng)元機(jī)械性損傷模型中過(guò)表達(dá)Homer1a后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組神經(jīng)元凋亡情況以及Wes-tern blot檢測(cè)各組神經(jīng)元凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組神經(jīng)元中cleaved caspase-3和Bax的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，Exp-Homer1a組神經(jīng)元中cleaved caspase-3和Bax的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Bcl-2的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05),見(jiàn)圖5。

Figure 4. LDH activity in the supernatant of neurons. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖4 各組神經(jīng)元上清液中LDH活性

5 過(guò)表達(dá)Homer1a可促進(jìn)機(jī)械性損傷神經(jīng)元中AMPKα蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組比較，模型組p-AMPKα表達(dá)水平升高；與模型組比較，Exp-Homer1a組p-AMPKα表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，見(jiàn)圖6。

討 論

在哺乳動(dòng)物中，Homer蛋白家族由Homer1、Homer2和Homer3三種亞型及其剪切體組成，屬于突觸后致密物質(zhì)家族的重要成員，主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，參與神經(jīng)元多種生理病理過(guò)程[12]。當(dāng)神經(jīng)元興奮性增強(qiáng)時(shí)，Homer1a的表達(dá)迅速上升，可調(diào)控突觸功能[13]。研究表明，過(guò)表達(dá)Homer1a可增強(qiáng)大鼠海馬的突觸傳遞及細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)流[14]。在重型顱腦損傷大鼠腦組織海馬區(qū)，Homer1a表達(dá)顯著增加，且在損傷6 h后出現(xiàn)最高峰[15]。本研究結(jié)果表明，機(jī)械性損傷的神經(jīng)元中Homer1a的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常神經(jīng)元，且過(guò)表達(dá)Homer1a可激活A(yù)MPKα的磷酸化，提高機(jī)械性損傷神經(jīng)元存活率。

LDH是參與機(jī)體能量代謝的一種重要的酶，廣泛存在于各種組織器官細(xì)胞的胞質(zhì)中，細(xì)胞受損后LDH被釋放到胞外。研究表明神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，腦脊液中LDH水平升高，與神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度呈正相關(guān)，因此，LDH釋放能精確地反映神經(jīng)元損傷狀況[16]。神經(jīng)元損傷時(shí)細(xì)胞能量代謝障礙、氧自由基釋放增多會(huì)促進(jìn)細(xì)胞中促凋亡因子Bax和Bad等的釋放，抑制抑凋亡因子Bcl-2的釋放，激活線粒體凋亡通路，最終使caspase-3切割活化，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[17]。本研究表明，過(guò)表達(dá)Homer1a能顯著降低機(jī)械性損傷神經(jīng)元中LDH活性，降低cleaved caspase-3和Bax的表達(dá)水平，升高Bcl-2的表達(dá)水平，有效抑制神經(jīng)元凋亡。AMPK在機(jī)體正常生理狀態(tài)下無(wú)活性，而當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)能量代謝障礙時(shí)，AMPK的α亞單位中的第485位絲氨酸、第172和258位蘇氨酸等均可發(fā)生磷酸化，其中第172位蘇氨酸及其磷酸化對(duì)AMPK活性和功能的調(diào)節(jié)起重要作用[18]。電針預(yù)處理可使腦缺血再灌注小鼠海馬中p-AMPKα的表達(dá)升高，可通過(guò)抑制細(xì)胞氧自由基的產(chǎn)生及Bax合成，增加細(xì)胞超氧化物歧化酶生成，增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化能力，從而清除氧自由基，減少海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡[19]。本研究結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)Homer1a可升高機(jī)械性損傷神經(jīng)元中p-AMPKα的表達(dá)，提示過(guò)表達(dá)Homer1a對(duì)機(jī)械性損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用與促進(jìn)AMPKα磷酸化的激活有關(guān)。

Figure 5. Effect of over-expression of Homer1a on neuronal apoptosis induced by mechanical injury. A： the protein levels of cleaved caspase-3, Bax and Bcl-2 were detected by Western blot; B: the apoptotic rate of each group was detected by flow cytornetry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖5 過(guò)表達(dá)Homer1a對(duì)機(jī)械性損傷誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的影響

Figure 6. The effect of over-expression of Homer1a on p-AMPKα protein level. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsmodel group.

圖6 過(guò)表達(dá)Homer1a對(duì)機(jī)械性損傷神經(jīng)元p-AMPKα表達(dá)的影響

綜上所述，過(guò)表達(dá)Homer1a對(duì)機(jī)械性損傷神經(jīng)元的保護(hù)作用，可能與通過(guò)促進(jìn)AMPKα磷酸化，減少cleared caspase-3及Bax的表達(dá)，降低神經(jīng)元LDH的活性有關(guān)。