茍美玲，張靜

(成都師范學院 化學與生命科學學院，成都 611130)

郫縣豆瓣醬被譽為“川菜之魂”，以二荊條紅辣椒、青皮蠶豆等為主要材料，通過自然發(fā)酵而成[1]。目前標準中雖然對郫縣豆瓣的理化指標提出了規(guī)范要求，但對郫縣豆瓣醬中的亞精胺含量未做相關規(guī)定。郫縣豆瓣醬中的亞精胺主要來源于原料蠶豆和發(fā)酵微生物的脫羧反應[2]。亞精胺具有抗氧化、抗炎、改善線粒體代謝的功能[3]。近年來，亞精胺的抗衰老活性越來越受到人們的關注[4]。亞精胺的許多抗衰老作用與受損細胞器的降解和自噬機制的激活使細胞質(zhì)材料的回收有關[5,6]。亞精胺也存在于人體內(nèi)，與人類健康息息相關[7]。適量的亞精胺有益于人體健康，但當其在動物和人體內(nèi)積聚達到高水平或其攝入過量時會變得具有毒性[8]，可能引起頭痛、頭暈、惡心、心悸等癥狀[9,10]，因此有必要對郫縣豆瓣中亞精胺的含量進行有效檢測和控制。

由于亞精胺結(jié)構(gòu)中沒有生色基團，既沒有紫外吸收，也沒有熒光及電化學活性，使得亞精胺的分離和測定都存在一定的困難，目前文獻報道的測定亞精胺的方法主要有氣相色譜法(GC)[11]、高效液相色譜法(HPLC)[12]、離子色譜法(IC)[13]、薄層色譜法(TLC)[14]、生物傳感器法[15]、毛細管電泳法(CE)[16]等。

由于高效液相色譜法具有分離效率高、分析速度快、柱效高、檢測靈敏度高、定量分析準確等特點，國家標準GB/T 5009.208-2008和許多文獻中均使用高效液相色譜法測定食品中的亞精胺含量。但是高效液相色譜法需要將目標物進行柱前或柱后衍生之后才能進行檢測，因此存在衍生產(chǎn)物不穩(wěn)定、操作復雜、反應條件苛刻、質(zhì)量控制相對較難等不足，顯然不適合作為郫縣豆瓣醬的大量檢測。因此，本文旨在建立一種簡單、快速的亞精胺檢測方法，適用于大批量郫縣豆瓣醬中亞精胺的監(jiān)控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗所用10種豆瓣醬均購于成都某超市，命名為YP-1～YP-10。

亞精胺標準品：上海源葉生物科技有限公司；乙腈(色譜級)：美國Sigma公司；甲酸(色譜級)：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

X500R飛行時間質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源，ESI) 美國AB SCIEX公司；超高效液相色譜系統(tǒng) 日本SHIAMDZU公司；Heto-HSC500真空冷凍干燥機 上海佰蕾真生物科技有限公司；SB-5200 DNT超聲清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司；萬能高速粉碎機 深圳尼嘉商貿(mào)有限公司；TD-5M離心機 四川蜀科儀器有限公司；IKA Vortex 2渦旋混勻器 德國IKA公司；Milli-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

分別稱取50 g樣品于-50 ℃真空冷凍干燥機中24 h，干燥后用萬能高速粉碎機粉碎，過80目篩，然后盛裝在潔凈的密封袋中，備用。

稱取0.5 g樣品粉末于50 mL離心管中，加入20 mL色譜級乙腈，渦旋30 s，于20 ℃超聲提取30 min，4000 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)0.22 μm有機濾膜過濾后進行質(zhì)譜分析。

1.3.2 標準溶液的制備

準確稱取1 mg(精確至0.00001 g)亞精胺標準品，加入10 mL乙腈溶液，配制成0.1 mg/mL的標準儲備液，-20 ℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 超高效液相色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；柱溫：30 ℃，流速：0.2 mL/min，進樣量：2 μL；流動相A為乙腈，流動相B為0.1%甲酸水溶液；洗脫梯度：0～3 min，20%～50% A；3～5 min，50%～100% A；5～7 min，100% A；7～10 min，100%～20% A；柱溫：30 ℃，流速：0.2 mL/min，進樣量：2 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(electron spray ionization，ESI)，正離子模式；噴霧氣1(gas 1)：45 psi，噴霧氣2(gas 2)：50 psi；氣簾氣(CUR)：35 psi；溫度：500 ℃；離子化電壓：5500 V；去簇電壓(declustering potential，DP)：60 V；碰撞能量(collision energy，CE)：20 V。全掃使用Q-TOF的IDA，一級質(zhì)量掃描范圍m/z 50～250。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的確定

2.1.1 母離子選擇

以20 mg/L的亞精胺標準溶液為實驗對象，在正離子掃描模式下進行母離子全掃描，掃描范圍m/z 50～250，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，響應強度最高的為m/z 146.1644 離子，響應強度高達1.5×106cps，由亞精胺分子式C7H19N3可知該離子為亞精胺的加氫離子，因此選擇m/z146.1644離子為母離子。

2.1.2 子離子選擇

以加氫離子m/z 146.1644為母離子進行二級質(zhì)譜掃描，亞精胺的二級質(zhì)譜圖見圖2，其主要產(chǎn)生5個碎片離子，分別為m/z 129.1386，112.1120，84.0808，72.0806，58.0651。

由圖2可知，碎片離子m/z 72.0806是響應值最高的子離子，因此選擇m/z 146.1649/72.0806為定量離子對，其次為m/z 112.1120，因此選擇m/z 146.1649/112.1120為定性離子對。

2.1.3 MRM優(yōu)化結(jié)果

由圖2可知，m/z 146.1649/72.0806為定量離子對，m/z 146.1649/112.1120為定性離子對。因此以子離子m/z 72.0806和m/z 112.1120的響應強度為評價指標，對亞精胺的去簇電壓及碰撞能量進行優(yōu)化，結(jié)果見圖3。

圖1 亞精胺標準品溶液母離子掃描質(zhì)譜圖Fig.1 Scanning mass spectrometry of precursor ion in spermidine standard solution

圖2 亞精胺標準溶液二級質(zhì)譜圖Fig.2 Scanning mass spectrometry of fragment ions in spermidine standard solution

圖3 MRM條件優(yōu)化：去簇電壓(A)和碰撞能量(B)Fig.3 MRM condition optimization: declustering potential (A) and collision energy (B)

由圖3A可知，碎片離子m/z 72.0806和m/z 112.1120在去簇電壓為65 V時達到最大響應值。當去簇電壓超過65 V時，二者的響應值均有不同程度的下降，因此選擇65 V為最佳的去簇電壓。由圖3B可知，碎片離子m/z 72.0806和m/z 112.1120的響應強度隨碰撞能量的增加而增加，當碰撞能量達到25 V時獲得了最大響應值，因此選擇25 V為最佳碰撞能量。

2.2 方法學研究

在本研究中，通過測定加標回收率、基質(zhì)效應、檢出限、定量限、精密度來驗證方法的準確性。

2.2.1 方法的線性范圍、檢出限和定量限

將亞精胺標準儲備液用乙腈稀釋成5個濃度：10.0，4.0，2.0，1.0，0.5 mg/L。按優(yōu)化好的實驗條件進行分析，以亞精胺標準溶液的濃度(x)為橫坐標、峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸，得到標準曲線和相關系數(shù)R2。檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別以標準溶液3∶1和10∶1進行計算，結(jié)果見表1。

表1 方法的線性參數(shù)、基質(zhì)效應、檢出限及定量限Table 1 Linear parameters, matrix effect, detection limits and quantification limits of the method

由表1可知，亞精胺在0.5～10 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關系數(shù)R2>0.999，檢出限為0.031 mg/kg，定量限為0.121 mg/kg。

2.2.2 基質(zhì)效應

在使用UPLC-MS/MS測定樣品中亞精胺含量時，由于基質(zhì)中不易揮發(fā)的共洗脫成分在噴霧液滴轉(zhuǎn)移到氣態(tài)離子的過程中會與目標分析物產(chǎn)生競爭關系，使得目標分析物的質(zhì)譜信號增強或者減弱，從而影響實驗方法的精密度、準確度[17,18]。盡管串聯(lián)質(zhì)譜法具有高靈敏度和高選擇性，也依然不能從根本上消除基質(zhì)效應[19]，因此對基質(zhì)效應的研究具有重要意義。

基質(zhì)匹配標準溶液是用樣品提取液溶解標準品，然后用樣品溶液對其進行連續(xù)稀釋。本研究隨機采用YP-1和YP-2作為基質(zhì)效應測定的2種基質(zhì)，分別用YP-1和YP-2溶解稀釋亞精胺標準品，最終亞精胺濃度范圍為0.55～6.25 mg/mL。

由表1可知，亞精胺在YP-1和YP-2的基質(zhì)效應分別為-17.72%和-17.42%，2個樣品的基質(zhì)效應較為接近，其絕對值均小于20%，因此可以認為其幾乎沒有基質(zhì)效應?？梢哉J為，郫縣豆瓣醬中的基質(zhì)對亞精胺含量檢測的影響不顯著，因此可以直接采用標準曲線對亞精胺進行定量分析。

2.2.3 精密度與回收率

在上述優(yōu)化好的條件下，在樣品中添加高、中、低單個濃度的亞精胺，每個濃度平行測定6次，測定其加標回收率和精密度。精密度用相對標準偏差表示。本實驗選擇YP-1和YP-2測定其加標回收率和精密度，結(jié)果見表2。

表2 方法的加標回收率和精密度測定結(jié)果(n=6)Table 2 The detection results of recovery rates and precision of the method (n=6)

由表2可知，亞精胺的平均回收率在92.65%～100.58%范圍內(nèi)，RSD在2.01%～6.98%范圍內(nèi)，表明此UHPLC-Q-TOF方法的準確性和穩(wěn)定性較好，可用于快速檢測樣品中亞精胺的含量。

2.3 樣品的測定

由于紅油豆瓣醬中具有較為完整的蠶豆瓣子以及較大塊的辣椒皮，因此首先對樣品進行勻漿均質(zhì)處理，使其呈現(xiàn)較為均勻的醬體形態(tài)。采用上述建立的UHPLC-Q-TOF方法對10種市售品牌紅油豆瓣醬中的亞精胺含量進行測定，結(jié)果見表3。

表3 10種郫縣紅油豆瓣醬樣品中亞精胺的含量Table 3 The content of spermidine of 10 kinds of Pixian bean paste mg/kg

續(xù) 表

注：同列肩標不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

由表3可知，亞精胺含量范圍為12.1～29.2 mg/kg，不同品牌紅油豆瓣醬中的亞精胺含量均有顯著性差異(p<0.05)，亞精胺含量最高的樣品(YP-2)是含量最低的樣品(YP-6)的2.4倍。豆瓣醬中亞精胺含量主要來源于原料蠶豆和發(fā)酵微生物的作用，各品牌廠家的原料來源、配比和制作工藝等因素都會影響亞精胺的含量，因此今后有必要對郫縣豆瓣醬中的亞精胺含量建立質(zhì)量標準。

3 結(jié)論

本實驗建立了利用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜串聯(lián)技術(shù)快速測定郫縣豆瓣醬中亞精胺含量的方法。實驗以乙腈為提取溶劑，在正離子掃描模式下，采用65 V為最佳的去簇電壓，25 V為最佳的碰撞能量對10種市售品牌郫縣紅油豆瓣醬中的亞精胺含量進行了測定，并對方法進行了系統(tǒng)校驗。實驗結(jié)果表明，亞精胺標準品在設定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好(R2>0.999)，加標回收率在92.65%～100.58%之間，實驗重復性和儀器精密度較好。

綜上所述，本實驗建立的UHPLC-Q-TOF方法簡單可行，可在短時間內(nèi)對郫縣豆瓣醬中的亞精胺進行準確的定性定量分析。