楊靜 阿古拉

【摘?要】目的：研究五味沙棘泡騰片中沙棘膏、白葡萄干、甘草、梔子的最佳提取工藝。方法：采用Agilent C18 色譜柱（250mm×4.6mm，5μm;流動(dòng)相為甲醇：0.4%磷酸水溶液（65∶35），流速1mL·min-1，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)370nm，進(jìn)樣10μL;綜合以槲皮素、山柰素、異鼠李素的總量為指標(biāo)選取最佳工藝;采用L9（34）正交實(shí)驗(yàn)法，優(yōu)取醇提法的最佳提取方法。結(jié)果：優(yōu)選出最佳提取工藝：75%乙醇，物料比為1∶8，提取1h，提取2次。槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量分別是0.427mg/g、0.370mg/g、2.833mg/g。結(jié)論：確定五味沙棘泡騰片中沙棘膏、白葡萄干、甘草、梔子的最佳提取工藝，為泡騰片劑研究和質(zhì)量控制提供依據(jù)。

【關(guān)鍵詞】五味沙棘泡騰片;槲皮素;山柰素;異鼠李素;正交實(shí)驗(yàn)法

【中圖分類號(hào)】R284.2?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）6-0020-05

五味沙棘方是蒙藏醫(yī)臨床常用的傳統(tǒng)方藥之一，全方由沙棘膏、木香、白葡萄干、甘草、梔子5味藥組成， 沙棘膏為方中君藥，含多種黃酮化合物，主要有異鼠李素、異鼠李素-3-β-D-葡萄糖苷、異鼠李素-3-β-D-蕓香糖苷、槲皮素、山奈素。方中以味酸，性溫，銳而有止咳、祛痰、除巴達(dá)干功效的沙棘膏為主;以排膿、祛痰的木香為輔，配以白葡萄干以清肺熱、止咳、平喘，甘草以清熱，止咳、祛痰，梔子以清血熱為之佐使。功能主治清熱祛痰、止咳定喘，臨床用于肺熱久咳、喘促痰多、胸中滿悶等?，F(xiàn)行2015年版《中國(guó)藥典》一部收載有五味沙棘散，且其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較為完善[1]，市場(chǎng)上已有五味沙棘顆粒、五味沙棘含片及五味沙棘口服液等，但有關(guān)泡騰片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究尚未見報(bào)道。鑒于此將其制成迅速溶解，吸收迅速，便于患者服用的口服泡騰片劑型。蒙藏醫(yī)臨床常用的傳統(tǒng)方藥，采用水平正交試驗(yàn)法，以方中君藥沙棘膏中槲皮素、山柰素、異鼠李素的總量作為提取工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)，來優(yōu)化提取工藝。

1?儀器與試藥

島津LC-20A型高效液相色譜儀（SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器、CBM-20A型控制器、CTO-20A柱溫箱、LC-20AT型輸液泵、SIL-20A型自動(dòng)進(jìn)樣器、LC solution色譜數(shù)據(jù)工作站、DGU-20A5型脫氣機(jī)），電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦有限公司），HH-D4型數(shù)控恒溫水浴鍋（金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠），甲醇、磷酸（天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司）、乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），色譜甲醇（SIGMA-ALDRICH），水為超純水，槲皮素、山柰素、異鼠李素（中國(guó)食品藥品檢定研究院），中藥材（內(nèi)蒙古天力藥業(yè)有限公司）

2?方法與結(jié)果

2.1?正交試驗(yàn)優(yōu)選提取工藝條件?由于處方中多數(shù)藥材的已知有效成分在乙醇中具有較好的溶解性[2-6]。故采用單因素考察后，選用L9（34）水平正交試驗(yàn)，以槲皮素、山柰素和異鼠李素含量對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化，所確定的正交因素水平見表1。

2.2?槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量測(cè)定

2.2.1?色譜條件?采用Agilent C18 色譜柱（250mm×4.6mm），5μm;流動(dòng)相為甲醇：0.4%磷酸水溶液（65∶35），流速1 mL·min-1，柱溫35℃，檢測(cè)波長(zhǎng)370nm，進(jìn)樣10 μL。

2.2.2?供試品溶液?取五味沙棘方中除木香外的其余四味藥，精密稱定， 置圓底燒瓶中， 精密加入8倍量的75%乙醇， 加熱回流lh，提取2次， 濾過放冷， 用旋轉(zhuǎn)蒸餾儀回收乙醇后將藥液定容于100mL容量瓶中備用。精密量取25mL，置具塞錐形瓶中， 加鹽酸3.5mL， 加熱回流水解1h， 立即冷卻， 移至50mL量瓶中， 用適量75%乙醇洗滌容器，洗液并入同一量瓶中，加75%乙醇至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.3?對(duì)照品溶液的制備?精密稱取槲皮素3.559mg、山柰素2.534mg、異鼠李素3.021mg分別置于100mL、100mL、10mL容量瓶中用甲醇溶解并定容，搖勻，濾過，即得對(duì)照品溶液

2.2.4?陰性對(duì)照試驗(yàn)?陰性對(duì)照提取液（處方中缺沙棘膏藥材），按提取物測(cè)定液的制備方法制備供試液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明其色譜在槲皮素、山柰素、異鼠李素相應(yīng)保留時(shí)間無峰，如圖1所示。說明處方中其他成分對(duì)測(cè)定結(jié)果無干擾。

2.2.5?線性關(guān)系考察?精密吸取“2.2.3”節(jié)下混合對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20μL，注入高效液相色譜儀，按“2.2.1”節(jié)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行回歸分析，所得結(jié)果見表2，3種黃酮在所測(cè)定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6?精密度試驗(yàn)?精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液10μL進(jìn)樣，按2.2.1項(xiàng)下重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得槲皮素、山柰素和異鼠李素的峰面積積分值，計(jì)算RSD分別為0.65%、0.74%、0.86%。表明方法精密度良好。

2.2.7?穩(wěn)定性試驗(yàn)?取提取液測(cè)定液，按0、2、4、6、8h不同時(shí)間間隔進(jìn)樣，測(cè)得槲皮素、山柰素和異鼠李素的峰面積積分值，計(jì)算RSD分別為1.03%、1.15%、1.52%，結(jié)果表明提取物測(cè)定液中槲皮素、山柰素和異鼠李素在8h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8?重復(fù)性試驗(yàn)?分別稱取樣品5份，按供試品溶液制備方法平行制備5份溶液，進(jìn)樣10μL，測(cè)定峰面積，連續(xù)進(jìn)樣2次，計(jì)算槲皮素、山柰素、異鼠李素含量的RSD分別為0.77%、0.57%、0.77%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.9?回收率試驗(yàn)?精密稱取已測(cè)知含量的五味沙棘提取物的樣品，分別加入不同質(zhì)量的槲皮素（見表3）山柰素（見表4）異鼠李素（見表5）對(duì)照品，按樣品溶液的制備方法制備樣品，測(cè)定其含量，計(jì)算回收率。

2.10?提取物含量測(cè)定?精密吸取正交試驗(yàn)各試驗(yàn)號(hào)提取液測(cè)定液10μL，按上述色譜條件依次進(jìn)樣，測(cè)定槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積積分值如圖1所示;經(jīng)計(jì)算槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量見表6。

2.3?試驗(yàn)結(jié)果分析?采用綜合平衡法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析和方差分析（SPSS統(tǒng)計(jì)軟件），結(jié)果見表6、表7。由表6中的R值可知，以槲皮素、山柰素、異鼠李素的總含量為指標(biāo)時(shí)，影響因素的大小順序均為A>C>D>B。說明溶劑濃度和提取時(shí)間是重要因素，提取次數(shù)和溶劑倍數(shù)次之。由方差分析結(jié)果可知，因素A、C對(duì)總含量的影響均有顯著性。結(jié)合極差分析，并按生產(chǎn)實(shí)際中降低消耗，提高效率的原則，確定五味沙棘泡騰片較優(yōu)的提取工藝條件為A2B3C1D2，即加入75%乙醇8倍量，提取2次，每次1h。

2.4?提取工藝的驗(yàn)證?按上述較優(yōu)的工藝進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證（n=6），結(jié)合槲皮素、山柰素、異鼠李素總含量的平均值為3.6300mg/g，表明所確定的較優(yōu)工藝合理可行。

3?討論

考慮到槲皮素、山柰素、異鼠李素的化學(xué)性質(zhì)，在進(jìn)行提取工藝條件的考察時(shí)，采用了65%乙醇、75%乙醇、85%乙醇 、95%乙醇作為溶媒進(jìn)行回流提取。結(jié)果表明，75%乙醇較優(yōu)，考慮到濃度為影響因素，故以70%、75%、80%為提取溶劑濃度進(jìn)行正交試驗(yàn)考察。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道沙棘膏中黃酮類化合物大多數(shù)以糖苷的形式存在，主要以槲皮素苷、山柰素苷、異鼠李素苷。如果直接測(cè)槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量發(fā)現(xiàn)及其低，難以反映黃酮類化合物的真實(shí)含量，因此試驗(yàn)中采取酸水解后測(cè)定槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量。為了盡可能短時(shí)間內(nèi)獲得較好的分離效果，對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，考察了不同組成的流動(dòng)相，如乙腈—水、甲醇—水、甲醇—酸系統(tǒng)，酸比較了磷酸和冰醋酸。結(jié)果表明磷酸可以減少色譜峰拖尾，使色譜峰達(dá)到較高的對(duì)稱性，改善了分離度，最終確定下條件為甲醇—0.4%磷酸水溶液為流動(dòng)相，峰形對(duì)稱，無拖尾現(xiàn)象，槲皮素保留時(shí)間為14min左右，山柰素保留時(shí)間為23min左右，異鼠李素保留時(shí)間在27min左右。

4?小結(jié)

在五味沙棘泡騰片的研制過程中，根據(jù)方中各味藥材中主要有效部位或有效成分的理化性質(zhì)，確實(shí)了五味沙棘泡騰片的工藝路線。采用正交試驗(yàn)法對(duì)醇提工藝進(jìn)行優(yōu)化，以槲皮素、山柰素和異鼠李素的總量為指標(biāo)，優(yōu)選了最佳煎煮工藝條件。通過劑型改進(jìn)，對(duì)全粉末的五味沙棘散中全部藥材進(jìn)行了提取，減少了服藥量，有助于有效部位或有效成分的溶出和吸收，加快了藥品的起效速度，同時(shí)便于服用、攜帶和貯藏，為患者提供了一種全新的給藥選擇方案。

對(duì)于蒙藥的標(biāo)準(zhǔn)建立為今天蒙醫(yī)藥的發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，從而強(qiáng)化蒙醫(yī)藥在防病、治病、保護(hù)和增進(jìn)人民群眾的健康事業(yè)中發(fā)揮獨(dú)特的、重要的和不可替代的作用，從而形成保持蒙醫(yī)藥特色的標(biāo)準(zhǔn)體系，建立規(guī)范的、科學(xué)的蒙藥材內(nèi)在的質(zhì)量控制體系，保證蒙藥制劑的質(zhì)量。

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（收稿日期：2019-01-07?編輯：程鵬飛）