姚千紅　徐舜　趙倩倩

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年4月～2018年4月我院收治的宮頸癌患者86例，納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)醫(yī)院初步檢查確診為宮頸癌且基本生命體征平穩(wěn)者;（2）具有詳細(xì)且完善的臨床治療資料者;（3）之前未接受過(guò)外科手術(shù)切除治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有精神疾病不能配合本研究者;（2）同時(shí)并發(fā)其他系統(tǒng)的嚴(yán)重疾病者。在回顧性總結(jié)我院對(duì)這86例患者的檢查方法的基礎(chǔ)上，依據(jù)是否在接受熒光PCR法進(jìn)行檢測(cè)篩查的基礎(chǔ)上聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒分型核酸測(cè)定篩查法，將其分為兩組。對(duì)照組患者接受熒光PCR法進(jìn)行檢測(cè)篩查，研究組患者在應(yīng)用熒光PCR法的基礎(chǔ)上聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒分型核酸測(cè)定進(jìn)行篩查。其中對(duì)照組43例，懷孕次數(shù)0～4次，平均（2.39±0.7）次;研究組43例，患者產(chǎn)次0～2次，平均（2.19±0.8）次，年齡20～50歲，平均（21.2±2.4）歲。患者均知情同意本研究，兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

對(duì)照組：采用常規(guī)的熒光PCR法進(jìn)行檢測(cè)篩查。第一，對(duì)待測(cè)基因進(jìn)行PCR;第二，電泳PCR結(jié)果;第三，分析結(jié)果：若無(wú)特定的擴(kuò)增片斷出現(xiàn)，說(shuō)明該診斷基因缺失;若擴(kuò)增片斷的大小與正?；虿煌f(shuō)明發(fā)生了突變。另外，對(duì)PCR擴(kuò)增片段直接測(cè)序，可以診斷未知突變基因核苷酸的改變。使用熒光PCR儀對(duì)其GAPDH含量進(jìn)行檢測(cè)，R：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，F(xiàn)：5'-GAAGGTGAAGGTCGGA-GTC-3'是引物;5'-fam-CAAGCT TCCCGTTCTCAG-CC-tamara-3'是針序列;210 bp是產(chǎn)物。反應(yīng)中含有模板（5 μL）、6 pmol探針、10 pmol引物、10 pmol Taq酶1.5 U、3.5 mmol MgCl2、200 μmol dNTPs以及10×buffer（2.5 μL），總體積為25 μL。反應(yīng)條件：在94℃下進(jìn)行10 min的預(yù)變性，94℃下進(jìn)行30 s的變性，62℃下進(jìn)行60 s的延伸和退火，共43個(gè)循環(huán)。

研究組：在應(yīng)用熒光PCR法的基礎(chǔ)上聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒分型核酸測(cè)定進(jìn)行篩查，具體檢測(cè)步驟：（1）收集患者的宮頸細(xì)胞樣本，首先暴露患者的宮頸，在過(guò)程中采用引導(dǎo)窺陰器，采用取樣器采集患者的宮頸脫落細(xì)胞。（2）樣本篩查：將采集的患者宮頸脫落細(xì)胞放入無(wú)菌管中，制備帶熒光的人乳頭瘤病毒分型單鏈核酸作為探針，通過(guò)PCR法擴(kuò)增該探針?lè)肿樱饕ㄗ冃?、?fù)性及延伸三步，之后在分子水平上進(jìn)行樣本的篩查;（3）如樣本檢測(cè)呈現(xiàn)陽(yáng)性或有明顯的癥狀出現(xiàn)，要進(jìn)行相關(guān)的細(xì)胞學(xué)檢測(cè);在無(wú)菌管中倒入保存液，靜置，除去上清液，進(jìn)行離心，把樣本烘干染色后進(jìn)行觀察;（4）進(jìn)一步行陰道鏡檢查，充分結(jié)合患者的陰道的檢查結(jié)果，如患者病情嚴(yán)重則可以采取宮頸活檢檢查，以液基細(xì)胞學(xué)及病理診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比，具體方法囑患者于月經(jīng)過(guò)后的3～7 d來(lái)院行電子陰道鏡檢查。首先選用被3%醋酸浸泡過(guò)的棉球，涂抹宮頸表面約30 s。然后將棉球取出，約2 min后，對(duì)宮頸表面行冷光源照射。當(dāng)宮頸表面由白色變?yōu)榘胪该靼咨⒃僮兊缴园蛋咨?、直至污濁灰白，而病變邊緣?jīng)過(guò)模糊-銳利-卷曲的變化。血管經(jīng)歷由細(xì)小均一的點(diǎn)狀血管變?yōu)殍偳吨梁竦拇姿岚咨掀け砻嫒狈ρ?，最后為粗大點(diǎn)狀血管。以上述結(jié)果作為評(píng)判依據(jù)，進(jìn)行陰道鏡下子宮頸癌的篩查。

1.3 觀察指標(biāo)

采用通用的Bethesda 系統(tǒng)（the Bethesda system，TBS）分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)診斷，結(jié)果為性質(zhì)未定的不典型鱗狀細(xì)胞（atypical squamous cells ofundetermined significance，ASCUS）及以上判斷為陽(yáng)性。對(duì)于活檢及LEEP 環(huán)切術(shù)組織，參考WHO（2003）《乳腺及女性生殖器官腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)分類(lèi)》，CINⅠ及以上判斷為陽(yáng)性。把LEEP 術(shù)后組織病理學(xué)診斷作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，TCT 篩查結(jié)果和陰道鏡下多點(diǎn)活檢病理診斷與LEEP 病理診斷在同級(jí)別之內(nèi)認(rèn)為符合，不在同一級(jí)別判為不符合。對(duì)接受檢查的兩組患者進(jìn)行密切的觀察研究并統(tǒng)計(jì)所有患者的高危型人乳頭瘤病毒感染率，并對(duì)處在不同年齡段的患者出現(xiàn)的感染情況進(jìn)行進(jìn)一步的分析統(tǒng)計(jì)，計(jì)算感染率，將兩組患者進(jìn)行比較，分析對(duì)不同的宮頸病變發(fā)生高危型人乳頭瘤病毒感染的幾率，感染率=（感染例數(shù)/總例數(shù)）×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析處理，計(jì)數(shù)資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料用（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡階段高危型人乳頭瘤病毒感染的情況

在接受檢測(cè)的86例患者中，有65例患者出現(xiàn)高危型人乳頭瘤病毒感染，總體的感染率75.6%;20～29歲患者的感染率為80.0%，30～39歲患者的感染率為66.7%，40～49 歲患者的感染率為82.1%，50～59歲患者的感染率為73.7%。不同年齡階段高危型人乳頭瘤病毒感染的情況不同（P<0.05）。見(jiàn)表1。

2.2兩組患者高危型人乳頭瘤病毒感染率比較

研究組檢測(cè)出的高危型人乳頭瘤病毒感染率高于對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)表2。

3討論

在臨床醫(yī)學(xué)中，女性發(fā)生宮頸癌的原因多種多樣，由很多的因素造成，如感染或其日常生活習(xí)慣不好、不衛(wèi)生、性生活紊亂或時(shí)間較早甚至是過(guò)多的進(jìn)行性生活，均有可能造成患者的宮頸感染，其中HPV感染引起的宮頸癌病變較為常見(jiàn)[3]。在人的身體機(jī)能中，宮頸是位于女性子宮下部較為狹窄的部分，呈現(xiàn)圓柱體的形狀，宮頸部陰道處一般分布著鱗狀上皮細(xì)胞，在宮頸管的內(nèi)部多呈現(xiàn)上皮細(xì)胞，并且宮頸陰道部的鱗狀上皮以及上皮可以在宮頸口進(jìn)行移動(dòng)[4]。一旦受到刺激或增加損傷，將增加病毒感染的機(jī)率，由于病毒入侵而導(dǎo)致宮頸上皮的不正常增生，即為醫(yī)學(xué)上的宮頸癌前發(fā)生病變[5]。在臨床上宮頸癌前病變?nèi)绻患皶r(shí)進(jìn)行干預(yù)，則最終將會(huì)引起發(fā)展成宮頸癌[6]。所以在臨床上最易引起宮頸癌的就是鱗狀上皮與柱狀上皮進(jìn)行交接移動(dòng)的地方[7]。一旦宮頸內(nèi)部的頸鱗狀上皮和柱狀上皮受到病毒損傷，讓病毒成功入侵，則會(huì)感染基底層的細(xì)胞，發(fā)生上皮細(xì)胞的不正常增生，如任其發(fā)展則會(huì)導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生[8]。在臨床醫(yī)學(xué)上HPV作為一種環(huán)形的病毒，以整合感染及允許感染兩種形式存在患者的身體內(nèi)，大多是在感染后，潛伏在基底的細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行不斷的繁殖增生，一般患者的自身免疫可以清除大部分的入侵病毒[9]。該病毒在患者的身體內(nèi)會(huì)潛伏1～2年的時(shí)間，如自身免疫系統(tǒng)在2年內(nèi)清除不了感染病毒，則會(huì)引起宮頸的感染，在這個(gè)過(guò)程中不進(jìn)行干預(yù)則最終導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生[10]。臨床上大部分宮頸癌患者均存在HPV 病毒與患者自身基因的整合，一旦HPV病毒與患者自身基因整合將會(huì)降低抑癌基因的發(fā)展，由此引起細(xì)胞的過(guò)度增殖，細(xì)胞增殖周期出現(xiàn)紊亂，失去正常的控制，細(xì)胞核的不正常分裂，將會(huì)導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生[11]。所以說(shuō)對(duì)于女性患者宮頸癌的篩查檢測(cè)采用熒光PCR法聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒分型核酸測(cè)定具有一定的臨床意義以及時(shí)代的價(jià)值[12]。

人乳頭瘤病毒（HPV）是一種雙鏈的DNA病毒，這種病毒可以感染皮膚以及體內(nèi)的上皮細(xì)胞，將導(dǎo)致患者體內(nèi)產(chǎn)生增殖病變的細(xì)胞及乳頭瘤樣改變[13]。人乳頭瘤病毒普遍存在于人類(lèi)的生活環(huán)境中，具有高度的組織性以及特異性，一旦感染將會(huì)引起患者細(xì)胞進(jìn)行不正常的增殖，產(chǎn)生宮頸感染[14]。在現(xiàn)代的醫(yī)學(xué)發(fā)展中，分別根據(jù)DNA基因的不同已經(jīng)產(chǎn)生近200種的人乳頭瘤病毒，其中約有1/4的類(lèi)型可以對(duì)人類(lèi)的生殖道進(jìn)行感染[15]。人乳頭瘤病毒還可以根據(jù)對(duì)人類(lèi)的感染力度分為低危型以及高危型兩種[16]。在臨床上對(duì)人乳頭瘤病毒檢測(cè)較為敏感的方法是熒光PCR 技術(shù)進(jìn)行篩查檢測(cè)，但是檢出率相對(duì)于熒光PCR法聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒分型核酸測(cè)定低，本研究表明，在接受檢測(cè)的86例患者中，有65例患者出現(xiàn)高危型人乳頭瘤病毒感染，總體的感染率75.6%;20～29歲患者的感染率為80.0%，30～39歲患者的感染率為66.7%，40～49歲患者的感染率為82.1%，50～59歲患者的感染率為73.7%。不同年齡階段高危型人乳頭瘤病毒感染的情況不同（P<0.05）;研究組檢測(cè)出的高危型人乳頭瘤病毒感染率高于對(duì)照組（P<0.05）。研究發(fā)現(xiàn)，采用熒光PCR法聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒分型核酸測(cè)定對(duì)宮頸癌癌前病變的篩查較為準(zhǔn)確，在臨床上有較高的參照價(jià)值。

綜上所述，熒光PCR法聯(lián)合高危型人乳頭瘤病毒分型核酸測(cè)定在宮頸癌癌前病變篩查中有著非常重要的作用以及對(duì)于醫(yī)學(xué)檢測(cè)具有指導(dǎo)作用，檢出率更高，效果理想，臨床上應(yīng)進(jìn)一步推廣應(yīng)用。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 賀國(guó)麗，吳秀榮，鄭碧娟.宮頸癌與癌前病變中高危人乳頭瘤病毒型別特征及差異分析[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志，2016，32（6）：459-461.

[2] Tsakogiannis D，Moschonas GD，Bella E，et al. Association of p16（CDKN2A） polymorphisms with the development of HPV16-related precancerous lesions and cervical cancer in the Greek population[J].Journal of Medical Virology，2018，90（5）：965-971.

[3] 齊艷紅.宮頸病變篩查中宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查與HPVDNA檢測(cè)的聯(lián)合應(yīng)用觀察[J].山東醫(yī)藥，2016，56（19）：58-59.

[4] 趙超，趙昀，崔淑慧，等.子宮頸液基細(xì)胞學(xué)、高危型HPV及聯(lián)合檢測(cè)在子宮頸癌機(jī)會(huì)性篩查中的價(jià)值[J].中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志，2016，28（2）：119-121.

[5] 徐舜，陳潔瑛，江海燕，等.宮頸癌前病變HPV感染與宮頸液基細(xì)胞早期篩查的臨床分析[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2017，27（20）：4739-4742.

[6] 宋艷波，王少明，董丹，等.內(nèi)蒙古地區(qū)液基細(xì)胞學(xué)與人乳頭瘤病毒分型檢測(cè)篩查宮頸癌的對(duì)比研究[J].中國(guó)婦產(chǎn)科臨床雜志，2016，17（1）：10-11.

[7] Mittal S，Basu P，Muwonge R，et al.Risk of high-grade precancerous lesions and invasive cancers in high-risk HPV-positive women with normal cervix or CIN 1 at baseline-A population-based cohort study[J].International Journal of Cancer，2017，140（8）：1850-1859.

[8] 陶志梅，潘敏，俞美娟，等.高危型人乳頭瘤病毒感染聯(lián)合液基薄層細(xì)胞檢測(cè)對(duì)宮頸癌及宮頸癌前病變篩查與隨訪的臨床意義[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2017，27（10）：2340-2343.

[9] 吳翠霞，張艷紅，葛小花，等.高危型HPV感染與宮頸癌前病變與宮頸癌的相關(guān)性研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2016，26（11）：2568-2570.

[10] Torii Y，F(xiàn)ujii T， Kukimoto I，et al.Comparison of methods using paraffin-embedded tissues and exfoliated cervical cells to evaluate human papillomavirus genotype attribution[J].Cancer Science，2016，107（10）：1520-1526.

[11] 萬(wàn)曉春，周曉燕，平波，等.九價(jià)HPV疫苗所針對(duì)的高危型HPV亞型在宮頸癌及其癌前病變中應(yīng)用有效性的初步預(yù)測(cè)[J].中國(guó)癌癥雜志，2017，27（7）：552-558.

[12] 張倩，胡尚英，馮瑞梅，等.高危型人乳頭瘤病毒感染變化與宮頸癌及癌前病變發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的15年前瞻隊(duì)列隨訪研究[J].中華腫瘤雜志，2016，38（10）：792-797.

[13] Badiga S，Chambers MM，Huh W，et al.Expression of p16INK4A in cervical precancerous lesions is unlikely to be preventable by human papillomavirus vaccines[J].Cancer，2016，122（23）：3615-3623.

[14] 李凌，李隆玉，楊起楠，等.高危型HPV載量與分型檢測(cè)對(duì)宮頸高級(jí)別病變預(yù)測(cè)價(jià)值的前瞻性隊(duì)列研究[J].中國(guó)腫瘤臨床，2016，43（9）：376-380.

[15] Liu G，Sharma M，Tan N，et al.HIV-positive women have higher risk of HPV infection，precancerouslesions，and cervical cancer：A systematic review and meta-analysis[J].Aids，2018，32（6）：1245-1378.

[16] Mejía L，Mu？觡oz D，Trueba G，et al.Prevalence of human papillomavirus types in cervical cancerous and precancerous lesions of Ecuadorian women[J].Journal of Medical Virology，2016，88（12）：2021-2278.

[17] 王曉光，辛志峰，李娜，等.人乳頭瘤病毒檢測(cè)與薄層液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)在宮頸癌篩查中的應(yīng)用[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展，2016，25（2）：140-142.

[18] Jiménez-Wences H，Martínez-Carrillo DN，Peralta-Zara-goza O，etal.Methylation and expression of miRNAs in precancerous lesions and cervical cancer with HPV16 infection[J].Oncology Reports，2016，35（4）：2297-2389.

[19] 張淼，周秀春，張冠群.人乳頭瘤病毒檢測(cè)及TCT檢查在宮頸癌篩查中的臨床價(jià)值研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué)，2016，43（5）：836-838.

[20] Wang X，Cheng K，Han Y，et al.Effects of Psoralen as an Anti-tumor Agent in Human Breast Cancer MCF-7/ADR Cells[J].Biological & Pharmaceutical Bulletin，2016，39（5）：815-822.

（收稿日期：2018-10-28）