冀雪莉 韋榮編 宋茹

摘要 [目的]以磁性Fe3O4粒子為基粒，采用溶膠-凝膠法在基粒表面鍵合二氧化硅，將基粒制成改性磁性納米Fe3O4用于吸附黃鯽蛋白抗菌肽中的活性肽，從而達到對黃鯽蛋白肽中有效抗菌組分的快速分離富集。[方法]黃鯽蛋白肽經(jīng)改性磁性納米Fe3O4吸附后，測定抑菌率、肽含量、蛋白質含量和氨基酸含量指標，再結合透射電鏡分析和高效液相分析結果，比較黃鯽蛋白肽在吸附前后的變化。[結果]透射電鏡結果顯示，改性磁性納米Fe3O4吸附黃鯽蛋白抗菌肽，可在粒子表面形成“冕層”。經(jīng)改性磁性納米Fe3O4吸附后，黃鯽蛋白抗菌肽液對大腸桿菌的抑菌作用顯著降低，其中黃鯽蛋白肽中的肽含量、蛋白質含量分別由吸附前的7.249 mg和416.221 μg降低至6.297 mg和346.183 μg，而吸附后肽液中氨基酸含量則略有提高。高效液相分析結果表明，黃鯽蛋白肽經(jīng)改性磁性納米Fe3O4吸附后主要分離峰的保留時間和峰面積均發(fā)生改變。[結論]改性磁性納米Fe3O4能有效吸附黃鯽蛋白肽中的抗菌肽，實現(xiàn)對抗菌組分的分離富集作用。

關鍵詞 黃鯽蛋白肽;抗菌;磁性Fe3O4粒子;表面修飾;富集

中圖分類號 TS254.4文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2019）10-0141-03

Abstract [Objective]The magnetic Fe3O4 particles was modified by combining the silica layer using the solgel method，with the aim of enrichment of antibacterial peptide from halffin anchovy hydrolysates （HAHp）.[Method]Determine the inhibition rate，peptide content，protein content and amino acid content of absorbed HAHp，and combine the results of transmission electron microscopy and high performance liquid phase analysis to compare the changes of HAHp before and after adsorption.[Result]Transmission electron microscopy showed that a coronal layer was formed on the surface of modified magnetic Fe3O4 after treated with HAHp.The antibacterial activity of HAHp was significantly reduced after adsorption by modified magnetic particles.The amounts of peptide and protein in HAHp were decreased from 7.249 mg to 6.297 mg，and 416.221 μg to 346.183 μg，respectively.By comparison，the amino acid content of HAHp was slightly increased after modified magnetic particles adsorption.Furthermore，the result of highperformance liquid phase analysis showed the changes of retention time and peak area for major peaks in HAHp after adsorbed by modified magnetic particles.[Conclusion]Our results suggested that the modified magnetic Fe3O4 particles could effectively enrich the antibacterial peptide from HAHp.

Key words Halffin anchovy peptides;Antibacterial activity;Magnetic Fe3O4 particles;Surface modification;Enrichment

黃鯽（Setipinna taty）屬于輻鰭魚綱、鯡形目、鳀科、黃鯽屬，在我國東海、南海、渤海等海域可以常年捕獲，且捕獲量較大[1]。通過酶解法制備的黃鯽蛋白肽除了抗菌活性外，還具有抗氧化、抑制腫瘤細胞增殖等生物活性[2-5]。前期研究中發(fā)現(xiàn)黃鯽蛋白肽的抑菌活性與其所帶電荷性有關[2]。磁性納米材料通常是由超順納米磁性粒子與無機或有機分子通過包覆或交聯(lián)等方式形成，可均勻分散于溶液中保持較高穩(wěn)定性。將磁性納米材料作為吸附劑，不僅具有較高的比表面積、良好的生物相容性，而且基于磁性材料的分離富集操作簡單，能夠快速達到吸附平衡，所以在生物工程中的應用越來越廣泛[6-7]。該研究以磁性Fe3O4為基粒，經(jīng)表面修飾改性使基粒表面帶有更多的荷電基團，如羥基、氨基[8]，將改性后的磁性Fe3O4用于吸附黃鯽蛋白肽中有效抗菌肽，以達到快速分離、富集抗菌肽的目的。

1 材料與方法

1.1 主要材料

黃鯽蛋白肽（浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院實驗室制備）;Fe3O4購于上海阿拉丁集團;檸檬酸三鈉購于宜興市第二化學試劑廠;正硅酸乙酯、乙醇、氨水、氫氧化鈉、氯化鈉、濃鹽酸、鄰苯二甲醛（OPA）、甲醇、十二烷基硫酸鈉（SDS）、四硼酸鈉、β-巰基乙醇、G-250考馬斯亮藍，均購于國藥集團化學試劑有限公司;營養(yǎng)瓊脂，購于青島海博生物技術有限公司;總氨基酸試劑盒和總巰基試劑盒，購于南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗方法

1.2.1 磁性Fe3O4納米粒子修飾改性。

參照文獻[9]的方法并適當修改，以Fe3O4為基粒，制備改性磁性Fe3O4粒子。

1.2.2 改性磁性Fe3O4納米粒子吸附黃鯽蛋白抗菌肽。

將磁性Fe3O4納米粒子與黃鯽蛋白肽按照1∶100比例（mg/mL）混合，微量振蕩器振蕩1 h，磁鐵分離磁性Fe3O4納米粒子，收集吸附后黃鯽蛋白肽，備用。

1.2.3 改性磁性Fe3O4納米粒子的微觀結構表征。透射電鏡法觀察改性磁性Fe3O4納米粒子吸附黃鯽蛋白肽后的微觀結構，未吸附黃鯽蛋白肽的改性磁性粒子為對照。

1.2.4 抑菌性測定。

參照96孔板法[4]測定，以大腸桿菌為指示菌，測定黃鯽蛋白肽經(jīng)改性磁性Fe3O4納米粒子吸附前后抑菌率。

1.2.5 肽、蛋白質和氨基酸含量測定。

測定黃鯽蛋白肽經(jīng)改性磁性Fe3O4納米粒子吸附前后的肽含量、蛋白質含量和氨基酸含量變化。肽含量的測定采用OPA方法[10]，蛋白質含量測定采用Bradford法[11]，氨基酸含量測定采用總氨基酸測定試劑盒法。

1.2.6 吸附前后黃鯽蛋白肽的色譜分離。

采用高效液相色譜法（HPLC）比較黃鯽蛋白肽經(jīng)改性磁性Fe3O4納米粒子吸附前后主要分離峰變化，具體條件如下：樣品經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，進樣量 10 μL，采用PL aquagel-OH柱（75 mm×300 mm，8 μm）分離，30%乙腈為洗脫劑，流速0.5 mL/min，柱溫25 ℃，檢測波長280 nm，根據(jù)保留時間和峰面積判定吸附前后黃鯽蛋白肽中主要分離峰變化情況。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用平均值 ± 標準差（n=3）形式表示，用SPSS 19.0 軟件對組間差異性進行顯著分析（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 改性磁性Fe3O4納米粒子吸附黃鯽蛋白肽前后微觀結構比較

從圖1可以看出，改性磁性Fe3O4納米粒子在吸附黃鯽蛋白肽之前具有較為規(guī)則的球形結構，尺寸分布較窄，粒徑均勻，直徑在100～200 nm。吸附黃鯽蛋白肽后改性磁性Fe3O4納米粒子直徑在50～250 nm，表面被淺層膜包裹，形成了“核殼結構”磁性粒子。磁性納米Fe3O4經(jīng)改性后可在粒子表面鍵合大量的-OH、-COOH等帶負電荷基團[12]。推測改性磁性Fe3O4納米粒子表面形成類似“水膜”層與黃鯽蛋白肽中的正電荷肽吸附到粒子表面有關。

2.2 黃鯽蛋白肽經(jīng)改性磁性Fe3O4納米粒子吸附后抑菌率變化

抑菌率和肽含量變化是評價改性磁性Fe3O4納米粒子對黃鯽蛋白肽中抗菌肽是否發(fā)生吸附的重要指標，如果經(jīng)納米粒子吸附后黃鯽蛋白肽的抑菌率和肽含量降低，說明黃鯽蛋白肽的有效抗菌肽組分被改性磁性Fe3O4納米粒子吸附。

從表1可看出，黃鯽蛋白肽對大腸桿菌的抑菌率由吸附前的42.52%降至吸附后的28.22%（P<0.05），經(jīng)測定黃鯽蛋白肽的肽含量和蛋白質含量分別由吸附前的7.249 mg和416.221 μg降低至6.297 mg和346.183 μg（P<0.05），而吸附后黃鯽蛋白肽溶液中氨基酸含量則由吸附前的14.656 mg提高至16.581 mg（P<0.05）。表明改性磁性Fe3O4納米粒子能有效吸附黃鯽蛋白肽中抗菌肽組分，綜合圖1微觀結構分析，說明被改性磁性Fe3O4納米粒子吸附到粒子表面形成的“水膜”應與抗菌作用有關的抗菌肽吸附有關。

2.3 黃鯽蛋白肽經(jīng)改性磁性Fe3O4納米粒子吸附后色譜分離

圖2a分離結果顯示黃鯽蛋白肽主要有7個分離峰，經(jīng)改性磁性Fe3O4納米粒子吸附后，圖2b中對應的峰2（P2）吸光強度降低明顯，說明峰2在吸附后的黃鯽蛋白肽中含量降低。另外，圖2a中峰5（P5）的保留時間在圖2b中延長。王嶺[12]報道磁性Fe3O4粒子經(jīng)表面改性后可以選擇性吸附疏水性多肽或荷電多肽。綜合以上結果，可以判定該研究所用的改性磁性Fe3O4納米粒子能有效吸附黃鯽蛋白肽中抗菌肽組分。

3 結論

該研究通過溶膠-凝膠法制備了改性磁性Fe3O4納米粒子，通過吸附試驗發(fā)現(xiàn)，被吸附后的黃鯽蛋白肽的抑菌率降低、肽含量和蛋白質含量降低、總氨基酸含量增加，說明改性磁性Fe3O4納米粒子能有效吸附黃鯽蛋白肽中抗菌肽，并能在磁性粒子表面形成蛋白或肽層。HPLC分離試驗表明，黃鯽蛋白肽中的一些分離峰經(jīng)改性磁性Fe3O4納米粒子吸附后，強度或保留時間變化明顯，原因可能是與吸附后的黃鯽蛋白肽的抗菌活性變化有關，后續(xù)還需進一步探究被吸附的肽組分特征。

參考文獻

[1] 宋茹，汪東風，謝超，等.黃鯽胃蛋白酶酶解液體外抗氧化、抑菌作用研究[J].食品科學，2010，31（3）：127-131.

[2] SONG R，SHI Q Q，YANG P Y，et al.Identification of antibacterial peptides from Maillard reaction products of half-fin anchovy hydrolysates/glucose via LC-ESI-QTOF-MS analysis[J].Journal of functional foods，2017，36：387-395.

[3] SONG R，SHI Q Q，ABDRABBOH G A A，et al.Characterization and antibacterial activity of the nanocomposite of half-fin anchovy （Setipinna taty） hydrolysates/zinc oxide nanoparticles[J].Process biochemistry，2017，62：223-230.

[4] 宋茹，韋榮編，謝超，等.黃鯽（Setipinna taty）蛋白酶解液的抑菌活性及穩(wěn)定性研究[J].食品科學，2010，31（13）：88-92.

[5] 宋茹.黃鯽（Setipinna taty）蛋白抗菌肽的制備及抗菌功能等生物活性研究[D].青島：中國海洋大學，2011.

[6] 匡敏.基于功能化磁性納米材料的糖肽富集與質譜鑒定新方法研究[D].上海：復旦大學，2013.

[7] 林本蘭，沈曉冬，崔升.納米四氧化三鐵磁性微粒的表面有機改性[J].無機鹽工業(yè)，2006，38（3）：19-21.

[8] 陳和美.基于功能磁性微納米材料的低豐度蛋白和肽組學富集新方法研究[D].上海：復旦大學，2010.

[9] 賀茂芳.功能化膜和磁性微球對生物分子的選擇性分離分析[D].西安：西北大學，2016.

[10] 劉揚，張占雄.多肽含量的測定方法的比較[J].內(nèi)蒙古石油化工，2008（5）：65.

[11] BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein binding[J].Analytical biochemistry，1976，72（1/2）：248-254.

[12] 王嶺.功能化磁性介孔納米復合材料的制備及肽組學分離分析研究[D].福州：福州大學，2014.