李冰,李玉雙,*,陳琳,魏建兵,史榮久,宋雪英,周紀(jì)東,侯永俠,劉厶瑤

1.區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,沈陽(yáng)大學(xué)環(huán)境學(xué)院,沈陽(yáng) 110044

2.污染生態(tài)與環(huán)境工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國(guó)科學(xué)院沈陽(yáng)應(yīng)用生態(tài)研究所,沈陽(yáng) 110016

0 前言

城市化是當(dāng)前中國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要過(guò)程,伴隨著城市化的快速推進(jìn)[1],土地利用的格局、深度和強(qiáng)度不斷發(fā)生變化,與城市化相關(guān)的土壤環(huán)境質(zhì)量問(wèn)題日益凸顯,這可能會(huì)對(duì)城市的生態(tài)安全及居民的身體健康造成影響[2]。

土壤酶與土壤質(zhì)量密切相關(guān),是土壤中具有生物活性的蛋白質(zhì)[3],參與土壤生態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行的諸多重要的物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量代謝過(guò)程[4-5]。大量研究表明,土壤酶活性具有綜合性、生物性和動(dòng)態(tài)性特點(diǎn),易受環(huán)境中物理、化學(xué)及生物因素的影響,可以反映土壤的狀態(tài)和動(dòng)態(tài)變化[6]。因此,土壤酶的活性變化成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者開(kāi)展土壤環(huán)境質(zhì)量研究的重要對(duì)象[7]。土壤脲酶是土壤中最為活躍的水解酶類(lèi)之一,能催化土壤中的尿素水解生成氨和CO2[8-9],其活性可以反映土壤的供氮能力,在土壤氮素循環(huán)中具有重要的作用[10]。不同來(lái)源的脲酶雖然其單體結(jié)構(gòu)有所不同,但通常都具有高度保守的氨基酸序列[11-12],使其具有十分相似的三維結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理,催化底物專(zhuān)一,可以有效排除土壤反應(yīng)體系中的干擾因素[13]。有研究表明,土壤脲酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)與土壤理化性質(zhì)密切相關(guān),將其活性作為土壤肥力水平的評(píng)價(jià)指標(biāo),具有一定的可靠性[14-15]。土壤微生物是土壤脲酶的重要來(lái)源,因此脲酶活性在一定程度還受到土壤微生物的影響[16]。而土壤微生物的組成和結(jié)構(gòu)對(duì)各種人為擾動(dòng)具有敏感的響應(yīng)[17-18]。

城市化進(jìn)程中,伴隨著土地利用方式的改變,人為擾動(dòng)強(qiáng)度增加,土壤理化性質(zhì)和土壤微生物的組成結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化。如遲旭雯[19]等研究發(fā)現(xiàn),黑土由旱田改水田后,土壤pH 升高;陳超等[20]研究結(jié)果表明,林地有機(jī)質(zhì)含量顯著大于草地和農(nóng)田;章家恩等[21]研究表明6 種不同土地利用方式下土壤微生物數(shù)量和多樣性具有顯著差別;彭木等[22]研究結(jié)果顯示農(nóng)田土壤的細(xì)菌數(shù)量大于林地土壤;還有文獻(xiàn)報(bào)道農(nóng)田土壤脲酶活性高于草地和林地[23]。這些研究表明,土壤理化性質(zhì)和土壤微生物對(duì)土地利用方式具有敏感的響應(yīng),這必然會(huì)對(duì)土壤脲酶的活性產(chǎn)生重要影響。然而目前關(guān)于不同利用方式下土壤的理化性質(zhì),尤其是優(yōu)勢(shì)微生物菌群與土壤脲酶活性之間關(guān)系的研究還不明確。

沈陽(yáng)市沈北新區(qū)是“國(guó)家可持續(xù)發(fā)展試驗(yàn)區(qū)”,近年來(lái)城市化發(fā)展迅速,大量農(nóng)業(yè)用地轉(zhuǎn)變?yōu)槌墙ㄓ玫?是我國(guó)城市擴(kuò)張的典型區(qū)域。因此,本文通過(guò)分析不同利用類(lèi)型土壤脲酶活性變化特征及其與土壤理化性質(zhì)、土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群之間的相關(guān)關(guān)系,探討城市擴(kuò)張區(qū)土壤脲酶活性的變化規(guī)律及其影響因素,為深入了解城市化對(duì)土壤環(huán)境質(zhì)量的影響提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤分布及樣品采集

采用均勻網(wǎng)格布點(diǎn)法在沈北新區(qū)全境共設(shè)置101 個(gè)采樣點(diǎn)(圖1),經(jīng)緯度范圍為123°16′44.45′′E— 123°42′44.27′′E,41°52′47.04′′N(xiāo)—42°10′4.33′′N(xiāo)。采樣時(shí)間為2015年9月15日—2015年10月6日,期間以晴和多云天氣為主。采樣點(diǎn)按土壤利用類(lèi)型分為旱田、城市綠地、天然林地和水田。其中,旱田采樣點(diǎn)47 個(gè),種植作物以玉米(34 個(gè),已收割)為主、其他為蘿卜、胡蘿卜、西紅柿、黃瓜等蔬菜(成熟期)及苜蓿;城市綠地采樣點(diǎn)17 個(gè),植物種類(lèi)主要為楊樹(shù)、山毛桃、火炬樹(shù)、灌叢、草坪草及雜草;天然林地采樣點(diǎn)15 個(gè),植被包括油松、榆樹(shù)、槭樹(shù)、蒙古櫟、楊樹(shù);水田采樣點(diǎn)22 個(gè),種植作物為水稻。采用梅花布點(diǎn)法,將土壤表層( 0—20 cm) 5 個(gè)位置的土壤樣品除去動(dòng)植物殘?bào)w及石塊,混合均勻,帶 回實(shí)驗(yàn)室,一部分于-20 ℃冷凍保存用于土壤微生物高通量測(cè)序;另一部分室溫風(fēng)干過(guò)篩,于4 ℃條件下保存供土壤酶分析使用,一周內(nèi)完成土壤酶活性測(cè)定。

圖1 沈北新區(qū)土壤采樣點(diǎn)分布示意圖 Figure1 Location of sampling sites in Shenyang North New Area

1.2 土壤理化性質(zhì)及脲酶活性測(cè)定

采用激光粒度儀測(cè)定土壤機(jī)械組成[24],分別測(cè)定土壤組分中0.01—2 μm 粒徑(粘粒)、2—20 μm 粒徑(粉粒)、20—200 μm 粒徑(砂粒)的含量;環(huán)刀法測(cè)定土壤容重;烘干法測(cè)定土壤含水量;玻璃電極法測(cè)定土壤pH 值(土:水=1:2.5);重鉻酸鉀-外加熱法測(cè)定土壤有機(jī)質(zhì)含量;重鉻酸鉀-硫酸消化法測(cè)定總氮;高氯酸、硫酸-鉬銻抗比色法測(cè)定總磷[25]。土壤脲酶活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測(cè)定[26],每個(gè)樣品三次重復(fù)。

1.3 土壤細(xì)菌群落組成分析

采用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定土壤微生物群落結(jié)構(gòu),選用Powersoil DNA Isolation Kit (MoBio,USA)試劑盒提取土壤基因組DNA,經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳定性檢查以保證條帶單一,采用Nanodrop 2000 (Thermo,UAS)測(cè)定DNA 濃度及純度,然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。采用515F 和909R 引物擴(kuò)增16S rRNA基因的V4 高變區(qū)片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化、質(zhì)控后,建立Illumina 測(cè)序文庫(kù),采用Illumina Miseq 平臺(tái)進(jìn)行Paired-end 250 bp 測(cè)序,測(cè)序工作委托中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所完成。測(cè)序結(jié)果(.fastq)切除原始序列兩端的測(cè)序接頭后經(jīng)FLASH軟件拼接,然后用QIIME軟件根據(jù)barcode將序列分配到相應(yīng)樣品,去除低質(zhì)量序列和嵌合體之后,統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣品中的序列數(shù),以最少的序列數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品序列的重取樣,以保證每個(gè)樣品中含有的序列數(shù)相近,從而避免因序列數(shù)不同而導(dǎo)致的樣品間差異。然后生成OTU (Operational Taxonomic Unit,采用序列相似度閾值97%)表,從每個(gè)OTU 中挑選出1 條代表序列,與細(xì)菌16S rRNA 基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)Greengenes 進(jìn)行比對(duì),獲得各個(gè)OTU 的物種分類(lèi)信息。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

利用Arc GIS 10.2 繪制采樣點(diǎn)位圖及酶活性分布圖。采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析,采用最小差數(shù)法(LSD)進(jìn)行差異顯著性分析,通過(guò)Pearson(雙側(cè))相關(guān)分析判斷土壤脲酶活性與土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性。利用Excel2010 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行通徑分析。采用Canoco for Windows 4.5 軟件進(jìn)行冗余分析,探究土壤細(xì)菌菌群與脲酶活性及土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 沈北新區(qū)土壤脲酶活性變化特征

圖2 沈北新區(qū)不同利用類(lèi)型土壤脲酶活性空間分布特征 Figure2 Spatial distribution characteristics of urease activity in different utilization types of land in Shenyang North New Area

如圖2所示,沈北新區(qū)西北部的興隆臺(tái)錫伯族鎮(zhèn)、石佛寺朝鮮族錫伯族鄉(xiāng)、黃家錫伯族鄉(xiāng)等以水田為主的地區(qū)土壤脲酶活性較低;南部離沈陽(yáng)主城區(qū)相對(duì)較近的道義街道、虎石臺(tái)街道、農(nóng)高區(qū)管委會(huì)蒲河新城管委會(huì)等以城市綠地和天然林地為主的 地區(qū)土壤脲酶活性居中;而位于沈北新區(qū)西部的尹家鄉(xiāng)、中部的財(cái)落街道、新城子街道及東部的清水臺(tái)鎮(zhèn)、馬剛鄉(xiāng)、蒲河街道等以旱田為主的地區(qū)土壤脲酶活性明顯高于其他地區(qū)?？傮w上,沈北新區(qū)土壤脲酶活性呈現(xiàn)出由東向西、由中部向南北逐漸降低的趨勢(shì),這主要與其土地利用類(lèi)型的區(qū)域分布有關(guān)。

2.2 不同利用類(lèi)型土壤脲酶活性變化特征

由圖3,旱田土壤平均脲酶活性(0.52 mg·g-1)顯著高于其他三種類(lèi)型土壤(P＜0.05);天然林地(0.34 mg·g-1)和城市綠地(0.32 mg·g-1)土壤脲酶平均活性次之,二者差異不明顯;水田土壤脲酶平均活性(0.19 mg·g-1)最低。梁毅等研究也發(fā)現(xiàn)不同土地利用方式影響土壤脲酶的活性,具體表現(xiàn)為:旱地＞林地＞果園＞灌叢[27],這與本文旱田土壤脲酶活性高于天然林地和以灌叢、草地為主的城市綠地的研究結(jié)果基本一致。這說(shuō)明土地利用方式對(duì)土壤脲酶活性具有較大的影響。在城市化過(guò)程中,大量農(nóng)業(yè)用地轉(zhuǎn)變?yōu)槌墙ㄓ玫?其土壤脲酶活性也會(huì)發(fā)生相應(yīng)地改變,直接影響土壤的供氮能力,從而改變土壤環(huán)境質(zhì)量。就農(nóng)業(yè)用地而言,旱田改為城市綠地后土壤脲酶活力將會(huì)下降,土壤供氮能力減弱;而水田變更為城建用地后其土壤脲酶活力將會(huì)提高,土壤供氮能力增強(qiáng)。

圖3 沈北新區(qū)不同利用類(lèi)型土壤脲酶活性變化特征 Figure3 Change characteristics of urease activity of different utilization types of land in Shenyang North New Area

2.3 土壤理化性質(zhì)對(duì)土壤脲酶活性的影響

由表1,土壤脲酶活性與土壤含水量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P＜0.01),與總磷含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P＜0.05),而與土壤pH、容重、機(jī)械組成、有機(jī)質(zhì)、總氮相關(guān)性不顯著;說(shuō)明土壤含水量和總磷是影響土壤脲酶活性的重要因素。土壤含水量與土壤機(jī)械組成呈極顯著相關(guān)關(guān)系(P＜0.01),總磷與有機(jī)質(zhì)和總氮呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01),說(shuō)明土壤機(jī)械組成、有機(jī)質(zhì)和總氮對(duì)土壤脲酶活性也具有一定的影響。

通徑分析結(jié)果(表2)表明,土壤含水量和總磷對(duì)土壤脲酶活性影響的直接通徑系數(shù)和綜合通徑系數(shù)均較大,說(shuō)明其直接作用明顯,并最終表現(xiàn)出強(qiáng)烈的綜合作用。粘粒、砂粒、有機(jī)質(zhì)和總氮對(duì)脲酶活性的直接通徑系數(shù)較大,綜合通徑系數(shù)較小,說(shuō)明其直接作用明顯,但綜合作用不明顯。此外,通過(guò)分析還可發(fā)現(xiàn),含水量、粘粒、砂粒三者及總磷、總氮、有機(jī)質(zhì)三者通過(guò)彼此間對(duì)脲酶活性的間接通徑系數(shù)均較大,說(shuō)明它們彼此間的相互作用對(duì)脲酶活性也有較大的影響。該分析結(jié)果與表1所示的土壤理化性質(zhì)與脲酶活性的相關(guān)關(guān)系相一致。

表1 土壤脲酶活性與不同土壤理化性質(zhì)的相關(guān)關(guān)系 Table1 Correlation between soil urease activity and soil physical and chemical properties

表2 土壤理化性質(zhì)對(duì)脲酶活性的通徑系數(shù) Table2 Path coefficient of soil physical and chemical properties to urease activity

土壤含水量是影響脲酶活性的重要因子,土壤水分可以直接影響酶活性的高低,也可以通過(guò)影響微生物的生長(zhǎng)和土壤養(yǎng)分的有效性間接影響土壤酶活性[28]。萬(wàn)忠梅等[29]研究發(fā)現(xiàn)干濕交替和較干旱條件下土壤脲酶活性高于持續(xù)淹水狀況下的活性,并且隨含水量的增加酶活性降低;朱同彬等[28]研究表明,較高的土壤含水量會(huì)顯著抑制土壤脲酶活性,這些研究結(jié)論與本文研究結(jié)果相一致。土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷通過(guò)直接和間接作用成為影響脲酶活性的重要因素。Liu SY 等[30]研究指出土壤脲酶活性與土壤有機(jī)物質(zhì)、全氮和全磷含量呈正相關(guān)。陶寶先等[31]經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),脲酶與全磷、有機(jī)質(zhì)在P＜0.01 水平下呈顯著正相關(guān),與全氮在P＜0.05 水平下呈顯著正相關(guān)。土壤機(jī)械組成對(duì)土壤物理、化學(xué)和生物學(xué)特性具有重要的影響。土壤機(jī)械組成變化有助于改變土壤緊實(shí)度、通透性能及肥力狀況,因此也會(huì)影響土壤微生物活動(dòng)和土壤酶活性[32-35]。本研究結(jié)果表明土壤機(jī)械組成與土壤含水量顯著相關(guān),粘粒、粉粒含量增加,土壤持水能力增強(qiáng),含水量提高;而砂粒含量增加,土壤結(jié)構(gòu)疏松,孔隙增大,含水量下降,說(shuō)明土壤機(jī)械組成可以通過(guò)土壤含水量間接影響脲酶酶活性。

2.4 土壤細(xì)菌群落組成對(duì)土壤脲酶活性的影響

土壤微生物是土壤的重要組成部分[36],大部分土壤酶是微生物新陳代謝過(guò)程中釋放的活性物質(zhì),因此酶活性在一定程度上取決于微生物的組成和結(jié)構(gòu)[37]。

通過(guò)對(duì)土壤樣品中微生物16S rRNA 基因的V4高變區(qū)進(jìn)行Illumina 測(cè)序,共檢測(cè)到70 個(gè)菌門(mén),其中出現(xiàn)相對(duì)豐度＞10%的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)共有9 個(gè),分別是泉古菌門(mén)(Crenarchaeota)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi)、藍(lán)藻細(xì)菌(Cyanobacteria)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)。

土壤中優(yōu)勢(shì)菌群豐度與理化性質(zhì)及脲酶活性的冗余分析(RDA)結(jié)果如圖4所示。從圖中夾角大小及射線長(zhǎng)度可以看出土壤細(xì)菌菌群、理化性質(zhì)及脲酶活性間的關(guān)系。射線間夾角為銳角時(shí)表示呈正相關(guān)關(guān)系,夾角越小,相關(guān)系數(shù)越大;射線越長(zhǎng),所對(duì)應(yīng)的變量影響越大。擬桿菌門(mén)(a4)、酸桿菌門(mén)(a2)、厚壁菌門(mén)(a7)、泉古菌門(mén)(a1)、放線菌門(mén)(a3)與土壤脲酶活性和砂粒含量呈正相關(guān)關(guān)系,而與土壤含水量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,表明這些菌群的豐度隨土壤持水能力的增加而減小,與上文土壤脲酶活性隨含水量升高而降低的變化趨勢(shì)相吻合,提示這些菌群可能是土壤脲酶的重要來(lái)源。其中,放線菌門(mén)、泉古菌門(mén)、酸桿菌門(mén)射線較長(zhǎng),相關(guān)系數(shù)較大,說(shuō)明其對(duì)土壤脲酶影響較強(qiáng)。

此外,冗余分析結(jié)果還表明酸桿菌門(mén)與土壤有機(jī)質(zhì)和總氮呈正相關(guān)關(guān)系,與土壤pH、容重、總磷呈負(fù)相關(guān)關(guān)系;而泉古菌門(mén)與土壤pH、容重、總磷呈正相關(guān)關(guān)系,與土壤有機(jī)質(zhì)和總氮呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,說(shuō)明這兩種菌群豐度還受到土壤有機(jī)質(zhì)、總氮、pH值、容重和總磷含量不同程度的影響。有研究表明,酸桿菌門(mén)細(xì)菌屬于嗜酸菌,分布范圍較廣,在沈北新區(qū)土壤中豐度較高可能與其土壤呈弱酸性有關(guān);泉古菌在非極端土壤環(huán)境中所占的比重非常高,這也預(yù)示其在土壤生物化學(xué)循環(huán)過(guò)程中的重要作用[38]。土壤微生物除受到土壤理化性質(zhì)的影響外,還存在著復(fù)雜的相互作用,如共生和競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系等,因而不同利用類(lèi)型土壤中微生物種群的變化規(guī)律及其對(duì)土壤酶活力的影響還需要進(jìn)一步探究。

圖4 土壤優(yōu)勢(shì)菌群豐度與理化性質(zhì)及脲酶活性的RDA 排序圖 Figure4 RDA sorting map of soil dominant bacterial abundance,soil physical and chemical properties and urease activity

3 結(jié)論

土地利用方式影響土壤脲酶活性,沈北新區(qū)不同利用類(lèi)型土壤脲酶活性由高到低依次為:旱田＞天然林地＞城市綠地＞水田。

土壤含水量和總磷對(duì)土壤脲酶活性的影響除了直接效應(yīng)外,還存在較強(qiáng)的通過(guò)其它因素的間接效應(yīng),是影響土壤脲酶活性的兩個(gè)主要因素。

土壤脲酶活性與放線菌門(mén)、泉古菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)菌群豐度呈正相關(guān)關(guān)系。其中,放線菌門(mén)、泉古菌門(mén)、酸桿菌門(mén)對(duì)土壤脲酶影響較大,可能是土壤脲酶的重要來(lái)源。