安 冏，李 堪，許曉明，高 準(zhǔn)，胡 超，李 博,3，狄 斌,3*，徐莉莉,3**

(1中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析系，南京 210009；2江蘇復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，海門 318099；3中國(guó)藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210009)

硫普羅寧[N-(2-巰基丙酰基)-甘氨酸](TP)是一種含巰基的化合物，屬罕見(jiàn)病用藥。其化學(xué)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1-a。目前，TP已廣泛應(yīng)用于多發(fā)性肝病[1]、胱氨酸尿癥[2]、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[3]和白內(nèi)障[4]。它還用于預(yù)防腎臟損害[5]，作為重金屬中毒的解毒劑[6]以及防輻射劑[7]。然而，TP存在許多不良反應(yīng)，如過(guò)敏反應(yīng)[8]、腎病綜合征[2]、肝毒性[9]和貧血伴隨血液異常[10]。值得注意的是，該藥物的一些不良反應(yīng)是由TP的有關(guān)物質(zhì)(RS)引起的，例如TP引起的過(guò)敏性休克，是由生產(chǎn)過(guò)程中的游離硫醇或雜質(zhì)引起的[11]。自1988年在美國(guó)上市以來(lái)，TP的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)至今尚未建立。因此，迫切需要一種有效的方法來(lái)檢測(cè)注射用硫普羅寧中的有關(guān)物質(zhì)，便于控制TP質(zhì)量，減少不良反應(yīng)。

本研究建立了一種新的、簡(jiǎn)便的、靈敏的高效液相色譜法分析注射用硫普羅寧中的有關(guān)物質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。該方法與現(xiàn)有報(bào)道方法(包括HPLC[12]、LC-MS[13]、GC-MS[14]、熒光法[15]、化學(xué)發(fā)光法[16]、分光光度法[17]、伏安法[18]和流動(dòng)注射分析[6]等)相比，具有明顯優(yōu)勢(shì)。而且，在分析過(guò)程中揭示了巰基化合物和甘氨酸類似物在反相色譜上的保留行為以及流動(dòng)相pH對(duì)待測(cè)物色譜行為的影響。根據(jù)國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì)議(ICH)準(zhǔn)則對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證，并對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行測(cè)定。本研究可為國(guó)內(nèi)外藥典注射用硫普羅寧質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供重要參考。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

TP對(duì)照品(純度≥99.0%，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；注射用硫普羅寧(江蘇復(fù)旦復(fù)華藥業(yè)有限公司，河南信義藥業(yè)有限公司)；TP原料(山東洛新制藥集團(tuán)有限公司)。雜質(zhì)對(duì)照品(其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示)：2-氯丙酰甘氨酸(RS 1，純度≥97.0%，武漢豐泰威源科技有限公司)；2-巰基丙酸(RS 5，純度≥97.0%，美國(guó)西格瑪-阿爾德里奇公司)；硫普羅寧二硫化物(RS 7，純度≥98.0%，加拿大多倫多研究化學(xué)品公司)。乙腈(HPLC級(jí)，美國(guó)Tedia公司)；其余試劑均為市售分析純。去離子水和蒸餾水由美國(guó)PALL純水儀制備。

Figure1 Chemical structures of (a) tiopronin (TP)，(b) 2-chloropropionylglycine (RS 1)，(c) 2-mercaptopropionic acid (RS 5) and (d1-d3) TP disulfide (RS 7)

1.2 儀 器

LC-20 AT高效液相色譜儀，SPD-M20A光電二極管陣列檢測(cè)器(PDA)(日本島津公司)；6520系列四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(Q-TOF，美國(guó)Agilent公司)；Thermo Scientific Syncronis C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)Thermo公司)；Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國(guó)Waters公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜-質(zhì)譜條件

Waters Symmetry C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈-0.1%甲酸水溶液(8∶92)為流動(dòng)相，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式,m/z范圍為50～600，樣品分流進(jìn)入質(zhì)譜，進(jìn)入質(zhì)譜的流速為0.3 mL/min，干燥氣流量為8 mL/min，毛細(xì)管溫度為325 ℃，碰撞電壓為25 V。

2.2 樣品溶液制備

分別在強(qiáng)酸(1 mol/L HCl，60 ℃持續(xù)1 h)、強(qiáng)堿(1 mol/L NaOH，60 ℃持續(xù)1 h)、高溫(濕熱環(huán)境和干熱環(huán)境分別為90 ℃和120 ℃，分別持續(xù)3 h和0.5 h)、氧化(3% H2O2，25 ℃，持續(xù)0.5 h)、光照(4 500±500 lx，25 ℃，1個(gè)月)條件下，對(duì)TP供試品溶液(1.0 mg/mL)進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)。

2.3 有關(guān)物質(zhì)的定性分析

TP供試品溶液強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)的色譜圖如圖2所示，共檢測(cè)到7種有關(guān)物質(zhì)(RS 2、3、4、5、6、7和8)，其保留時(shí)間分別為4.78、5.75、14.32、15.58、26.27、27.50和33.51 min。其中，RS 5和7為TP水解和聚合產(chǎn)物，二者均有對(duì)照品可供判斷，但注射用硫普羅寧中其他有關(guān)物質(zhì)以前從未報(bào)道過(guò)，也沒(méi)有任何對(duì)照品可供參考。因此，根據(jù)Q-TOF中母離子和產(chǎn)物離子的信息，合理地推導(dǎo)了它們的結(jié)構(gòu)。

Figure2 Typical UV spectrum (A) and the total ion chromatogram (B) of forced degradation solution of TP for injection.The figures represent the RS (RS 2- 8)

根據(jù)圖3，可以得出一些合理的RS轉(zhuǎn)換途徑。總結(jié)如下：RS 2是TP脫去巰基形成的，RS 3是TP與其降解產(chǎn)物結(jié)合形成的化合物，RS 4是TP的官能團(tuán)異構(gòu)體，RS 5是TP的水解產(chǎn)物，命名為2-巰基丙酸，RS 6是由TP的二聚體與其水解產(chǎn)物結(jié)合而形成的；RS 7是TP的二聚體，RS 8是由TP降解產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)而形成的。

2.4 色譜條件

Thermo Scientific Syncronis C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸(8∶92)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

2.4.1 RS 7的測(cè)定 TP常以外消旋形式被用于臨床，其結(jié)構(gòu)中具有一個(gè)手性中心，二聚體產(chǎn)物RS 7就有兩個(gè)手性中心，因此有3個(gè)不同的異構(gòu)體，如圖1-d所示。這3種異構(gòu)體可分為兩組對(duì)映體。在本研究中，RS 7分別在22和23 min出現(xiàn)雙峰，面積比為1∶1。這兩個(gè)峰是RS 7的兩組對(duì)映體，用目前的色譜系統(tǒng)可以達(dá)到部分分離(分離度為1.1)。因此，在本研究中根據(jù)兩個(gè)峰的總面積來(lái)計(jì)算RS 7的含量。

2.4.2 色譜條件的優(yōu)化-流動(dòng)相pH的優(yōu)化 在4.0～1.5范圍內(nèi)對(duì)流動(dòng)相pH進(jìn)行了考察，在pH 4.0時(shí)，TP不能與中間產(chǎn)物RS 1達(dá)到完全分離(圖4)，主要原因是在較高的pH條件下，巰基不能保持足夠的穩(wěn)定性。隨著流動(dòng)相pH從4.0降至1.5，TP的拖尾因子由0.60逐漸提高到1.05，理論塔板數(shù)也由2 312顯著增加到14 491。其主要原因是在pH較低的環(huán)境中TP解離受到抑制，從而使拖尾峰消失，柱效提高。

除此之外，TP的峰形也發(fā)生了變化(圖5)?？紤]到TP是半胱氨酸類似物，根據(jù)文獻(xiàn)[19]，半胱氨酸的pKa分別為1.71(-COOH)，8.18(SH)或8.37(-SH)，而色譜峰發(fā)生變形和分裂的原因是當(dāng)流動(dòng)相pH(pH 2.0)接近TP的pKa時(shí)，羧基解離和未解離狀態(tài)的量級(jí)相等，同時(shí)，它也可能伴隨著巰基和硅醇基的相互作用。隨著pH的進(jìn)一步降低，這種情況受到抑制，TP的峰形明顯改善。

pH和pKa對(duì)TP拖尾因子和塔板數(shù)的影響，在一定程度上解釋了TP及其雜質(zhì)在不同pH條件下具有不同的保留時(shí)間以及在pH 2.0時(shí)主峰發(fā)生分裂的原因。當(dāng)流動(dòng)相pH從4.0下降到3.0時(shí)，TP和RS 7在色譜柱上的保留增強(qiáng)，TP的保留時(shí)間從8 min推遲到12 min，RS 7的保留時(shí)間從15 min推遲到43 min。有趣的是，當(dāng)流動(dòng)相pH降低到1.5時(shí)，TP和RS 7的保留時(shí)間分別向9和24 min靠近。其原因可能與TP和RS 7的pKa有關(guān)。用ACD/Labs預(yù)測(cè)它們的pKa分別為3.4和3.0。由此推測(cè)，當(dāng)pH從4.0降到3.0時(shí)，TP和RS 7的羧基都是游離態(tài)的，分子間作用力增強(qiáng)，從而加強(qiáng)了它們的保留。當(dāng)pH降至1.5時(shí)，TP和RS 7的酰胺基結(jié)合氫離子，使保留減弱，色譜峰向前移。

Figure3 Plausible pathway showing the formation of product ions of RS 2 (m/z130)，RS 3 (m/z326)，RS 4 (m/z162)，RS 5 (m/z105)，RS 6 (m/z364)，RS 7 (m/z323) and RS 8 (m/z162)

Figure4 Chromatograms of system suitability solutions for different pH conditions with detection wavelength at 210 nm.The concentration of four reference substances:TP，RS 1，RS 5 and RS 7 were 100，10，10 and 15 μg/mL，respectively

Figure5 Chromatograms of sample solution at different pH conditions (pH 4.0- 1.5) with detection wavelength at 210 nm

除了上述提到的那些現(xiàn)象之外，RS 2也表現(xiàn)出類似的峰形、柱效和保留時(shí)間的改變。在pH 4.0時(shí)，其保留時(shí)間為3.8 min，柱效較低(理論塔板數(shù)5 490)。在pH降低后，色譜柱對(duì)RS 2的保留增加，RS 2的保留時(shí)間從3.8 min延遲到4.1 min。在pH 1.5時(shí)，RS 2的保留時(shí)間又向前移動(dòng)到3.8 min。這些結(jié)果表明，當(dāng)使用RP-HPLC分離巰基類化合物和甘氨酸類似物時(shí)，較高的流動(dòng)相pH會(huì)影響柱效，并可導(dǎo)致峰分裂。在低pH(約pH 1.5)的情況下，可以避免這些情況的發(fā)生，并提高柱效和分離度。

2.4.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 由于TP及其大部分雜質(zhì)只在200～230 nm有末端吸收，而且沒(méi)有明顯的吸收峰。為了保證盡可能多的雜質(zhì)能夠被檢測(cè)到并具有良好的靈敏度，在消除末端吸收和保證目標(biāo)化合物具有強(qiáng)紫外吸收的情況下，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為210 nm。

2.5 溶液配制

2.5.1 TP、RS 1、RS 5和RS 7對(duì)照品儲(chǔ)備液 分別精密稱取TP、RS 1、RS 5和RS 7對(duì)照品適量，用流動(dòng)相分別溶解并稀釋制成每毫升約含TP、RS 1、RS 5和RS 7 100 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液，-20 ℃貯存。

2.5.2 TP供試品溶液 精密稱取TP對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并稀釋制成每毫升約含TP 1 mg的溶液。

2.5.3 系統(tǒng)適用性溶液 精密量取TP、RS 1、RS 5和RS 7對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用流動(dòng)相稀釋并制成含每毫升含TP、RS 1、RS 5和RS 7分別為100、10、10和15 μg的溶液。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 系統(tǒng)適用性 取系統(tǒng)適用性溶液，按照“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。在該色譜條件下，TP與各雜質(zhì)以及各雜質(zhì)之間的分離度和理論塔板數(shù)最小分別為6.8(≥2.0)和15 057(≥2 000)。峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.64%和0.06%,均小于1.0%。拖尾因子在1.01～1.07之間,小于2.0。所有數(shù)據(jù)均符合驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)。由此可以看出，所建立的高效液相色譜系統(tǒng)適用于該分析方法。

2.6.2 專屬性 按照“2.2”項(xiàng)下的條件對(duì)TP供試品溶液進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)，并按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。當(dāng)樣品受到強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫、光照和氧化破壞時(shí)，會(huì)出現(xiàn)一些新的色譜峰，可與TP完全分離。最小分離度為1.9(≥1.5)。此外，在所有破壞試驗(yàn)中，TP主峰純度均合格，最小峰純度指數(shù)大于零，表明該峰不含雜質(zhì)。因此，該方法測(cè)定注射用硫普羅寧中的有關(guān)物質(zhì)具有專屬性。

2.6.3 回收率 取9份樣品，每份分別精密加入相當(dāng)于RS 1、RS 5和RS 7限度濃度的50%、100%和150%的RS對(duì)照品，配制低、中、高3種濃度的回收率溶液(n=9)，進(jìn)樣測(cè)定。TP、RS 1、RS 5和RS 7的平均回收率分別為100.03%(RSD為1.02%)、101.96%(RSD為0.58%)、102.41%(RSD為2.60%)和100.40%(RSD為0.71%)。

2.6.4 精密度 取注射用硫普羅寧自制制劑，分別加入RS 1、RS 5和RS 7的對(duì)照品，制成含限度濃度雜質(zhì)的模擬樣品；按“2.4”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。結(jié)果見(jiàn)表1。RS日內(nèi)精密度和日間精密度最大的RSD分別為1.69%和4.42%(≤5.0%)。結(jié)果表明，該方法具有較高的精密度。

2.6.5 檢測(cè)限(LOD)和定量限(LOQ) 將TP、RS 1、RS 5、RS 7的對(duì)照品儲(chǔ)備液逐步稀釋，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以S/N≥10得到TP、RS 1、RS 5、RS 7的定量限，以S/N≥3得到TP、RS 1、RS 5、RS 7的檢測(cè)限(見(jiàn)表1)，從表中可以看出，TP和雜質(zhì)(RS 1、RS 5和RS 7)的LOD和LOQ分別在0.102 0～0.399 1 μg/mL和0.309 2～1.197 μg/mL范圍內(nèi)。根據(jù)注射用硫普羅寧的雜質(zhì)限度，LOD和LOQ可分別達(dá)到0.01%和0.03%。結(jié)果表明，該方法對(duì)注射用硫普羅寧中的任何雜質(zhì)均有足夠的靈敏度。

2.6.6 線性和范圍 分別精密量取TP、RS 1、RS 5、RS 7的對(duì)照品儲(chǔ)備液，用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋，分別得到0.30～7.5 μg/mL (0.30，1.5，3.0，5.0，6.0和7.5 μg/mL)，0.30～7.5 μg/mL (0.30，1.5，3.0，5.0，6.0和7.5 μg/mL)，1.2～7.5 μg/mL(1.2，2.4，3.6，5.0，6.0和7.5 μg/mL)和1.2～50 μg/mL(1.2，5.0，15，25，40和50 μg/mL)范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度溶液，按“2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積和質(zhì)量濃度(μg/mL)分別表示為Y和X，進(jìn)行線性回歸，其線性方程見(jiàn)表1。結(jié)果表明，在不同濃度范圍內(nèi)各雜質(zhì)的線性關(guān)系良好。所有結(jié)果都符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.6.7 耐用性 通過(guò)改變流速(±0.1 mL/min)、柱溫(±5 ℃)、波長(zhǎng)(±2 nm)、流動(dòng)相中乙腈含量(±1%)和同一品牌不同批次分析柱等試驗(yàn)條件，考察該方法的耐用性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表2)。從表中可知，RSD為0.09%～6.41%，說(shuō)明該方法具有足夠的耐用性。

Table1 Validation results of introduced method for determination of related substances of tiopronin for injection

AnalyteLinearrange/(μg/mL)Regressionequation(x±s,n=3)rLOD/(μg/mL)LOQ/(μg/mL)Inter-dayprecisionRSD/%(n=6)Inter-dayprecisionRSD/%(n=12)TP0.30-7.5y=14961x-4470.99990.10200.30920.120.83RS10.30-7.5y=13818x-6540.99980.10320.31281.601.91RS51.20-7.5y=7108x-160.99990.38801.1641.691.41RS71.20-50y=21455x-44380.99980.39911.1970.864.42

aLow:80% level of limitation；bMiddle:100% level of limitation；cHigh:120% level of limitation

AnalyteFlowrate(±0.1mL/min)Columntemperature(±5℃)λ(±2nm)Acetonitrilecontent(±1%)DifferentcolumnTP101.0±0.1100.8±0.4101.1±0.2100.9±0.3101.0±0.3RS1100.3±0.6100.2±4.2100.0±4.8102.0±1.2103.4±0.9RS599.4±2.3101.7±5.899.8±6.4102.9±2.5101.5±2.0RS7104.2±4.7101.1±1.0100.1±1.0100.8±5.6100.6±3.0

2.6.8 溶液穩(wěn)定性 將RS 1、RS 5和RS 7的對(duì)照品溶液在室溫下放置24 h(時(shí)間點(diǎn)分別為0、1、2、4、6、8、10、16和24 h)，其峰面積的RSD(%)分別為0.11、0.30和0.19，在4 ℃冰箱中放置24 h(時(shí)間點(diǎn)分別為0、1、2、4、6、8、10、16和24 h)，其峰面積的RSD(%)分別為0.33、0.35和0.30。TP對(duì)照品溶液在室溫下放置24 h(時(shí)間點(diǎn)分別為0、2、4和24 h)，其峰面積的RSD(%)分別為0.43，在4 ℃冰箱中放置24 h(時(shí)間點(diǎn)分別為0、2、4、11、18和24 h)，其峰面積的RSD(%)為0.43。樣品溶液分別置于室溫和4 ℃冰箱中24 h(時(shí)間點(diǎn)分別為0、2、5、9、12、15、18、21和24 h)后，峰面積RSD(%)分別為0.15和0.23。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照品溶液和樣品溶液至少在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.7 樣品測(cè)定

根據(jù)HPLC方法的建立和驗(yàn)證，對(duì)13批注射用硫普羅寧樣品的RS進(jìn)行了研究。其中，RS 1作為合成過(guò)程中的一種可能的中間副產(chǎn)物并沒(méi)有被檢測(cè)到。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)未知雜質(zhì)中的主要雜質(zhì)(RS 2)在每一批中都有規(guī)律的再現(xiàn)。由于缺少RS 2的對(duì)照品，所以用自稀釋法計(jì)算其含量。注射用硫普羅寧的RS 2、RS 5、RS 7和總雜含量分別小于0.15%、0.07%、1.8%和2.0%。

3 討論與小結(jié)

本研究建立了一種新的、簡(jiǎn)便的測(cè)定注射用硫普羅寧的反相高效液相色譜方法，并對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。該分析過(guò)程揭示了巰基化合物和甘氨酸類似物在反相高效液相色譜上的保留以及流動(dòng)相pH對(duì)待測(cè)物色譜行為的影響。用該方法共檢測(cè)到7種有關(guān)物質(zhì)，并用LC-Q-TOF對(duì)其進(jìn)行了表征，包括過(guò)程工藝雜質(zhì)和降解產(chǎn)物，其中5種尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。由于流動(dòng)相組成簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)裝置通用性強(qiáng)，使該方法成為分析測(cè)定注射用硫普羅寧的首選方法，并為國(guó)內(nèi)外藥典對(duì)注射用硫普羅寧標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了重要參考。