劉雙平，謝雅茜，江正強(qiáng)，閆巧娟，毛 健，4

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫 214122；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院，北京100083；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京100083；4.浙江古越龍山紹興酒股份有限公司，國(guó)家黃酒工程技術(shù)研究中心，浙江紹興 312000）

黃酒是世界三大古酒之一，經(jīng)過(guò)制曲、浸米、蒸 煮、前酵、后酵、壓榨、澄清、煎酒、陳化、勾兌等生產(chǎn)工藝釀造而成，黃酒除飲用外，也可用作食醋釀造的原料。傳統(tǒng)黃酒制作過(guò)程中通過(guò)加入麥曲形成復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)和多酶復(fù)合體系（α-淀粉酶[1]、糖化酶[2]、普魯蘭酶[3]、蛋白酶[4]、纖維素酶[5]、脂肪酶[6-7]），從而降解原料中的蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪、粗纖維等成分為細(xì)胞所利用，但是由于麥曲質(zhì)量不穩(wěn)定、發(fā)酵控制不系統(tǒng)等因素會(huì)導(dǎo)致黃酒發(fā)酵速率緩慢，從而會(huì)影響出酒率及黃酒的品質(zhì)，甚至出現(xiàn)酸敗現(xiàn)象。

隨著釀酒科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，科研人員對(duì)黃酒釀造過(guò)程的深入研究，黃酒釀造工藝得到大幅改進(jìn)，特別是酶制劑在黃酒生產(chǎn)中的應(yīng)用，使得黃酒的品質(zhì)得到大幅提升[8-9]。而糖化酶在黃酒生產(chǎn)中的應(yīng)用則恰好彌補(bǔ)了傳統(tǒng)工藝中的不足之處，解決了麥曲中酶系和微生物產(chǎn)糖化酶活力不足的問(wèn)題。在減少麥曲用量的同時(shí)，使原料的糖化速率不會(huì)降低，在降低成本的同時(shí)又很好的保證了出酒率和黃酒的品質(zhì)。因此，尋找新型糖化酶用于黃酒釀造具有重要價(jià)值。

糖化酶[EC 3.2.1.3]即葡萄糖淀粉酶，屬于酸性單鏈糖苷水解酶，具外切酶活性。該酶能水解淀粉、糊精、糖原等碳水化合物非還原末端的α-1,4-糖苷鍵生成β-D-葡萄糖，同時(shí)也能緩慢水解α-1,6-葡萄糖苷鍵、少量α,β-(1,1)-、α-(1,2)-鍵和極少量α-1,3-鍵[10]，在黃酒生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用[11-12]。團(tuán)隊(duì)前期研究中篩選到1株能夠產(chǎn)糖化酶的嗜熱擬青霉（Paecilomyces thermophila）J18，并在畢赤酵母中對(duì)該糖化酶進(jìn)行了過(guò)量表達(dá)。本文將對(duì)表達(dá)得到的嗜熱擬青霉來(lái)源糖化酶（PtGA15）的酶學(xué)性質(zhì)做進(jìn)一步探究，并考察其在黃酒釀造中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑

原料：糯米，購(gòu)自超市。

糖化酶PtGA15：嗜熱擬青霉（P.thermophila）J18來(lái)源，畢赤酵母表達(dá)；分子量67 kDa，比酶活148.5 U/mg。

麥曲：上海金楓酒業(yè)股份有限公司。

活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

α-淀粉酶：樟絨枝霉來(lái)源，畢赤酵母表達(dá)，實(shí)驗(yàn)室分離純化保存；酶活11895 U/g，最適pH 6.5，最適溫度65℃，50℃以下能保持90%以上酶活力，pH5～10內(nèi)穩(wěn)定。

其他試劑：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器和設(shè)備

TU-1800PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；HZQ-F-160全溫振蕩培養(yǎng)箱，江蘇太倉(cāng)實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠(chǎng)；LRH-250S恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HWS24型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HGJR-02紅外加熱爐，河南中良科學(xué)儀器有限公司；PB21型pH計(jì)，德國(guó)賽多利斯公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 糖化酶（PtGA15）的酶學(xué)性質(zhì)

酶活力測(cè)定方法：取13 g/L可溶性淀粉溶液（以10 mM pH 6.0的醋酸緩沖液為溶劑）0.l mL，70℃預(yù)熱5 min，加入0.l mL酶液，70℃反應(yīng)20 min，加入1.0 mL DNS試劑，沸水浴反應(yīng)15 min，速冷，在540 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，0.l mL蒸餾水代替酶液做對(duì)照。酶活力定義：以1 min催化底物生成l μmol的葡萄糖所需酶量定義為一個(gè)酶活單位。

1.3.1.1 最適pH值及其穩(wěn)定性

最適pH值測(cè)定：在70℃條件下，以pH值及不同體系的緩沖液（Citrate，pH3.0～6.0；Mcilvaine，pH3.0～7.0；Acetate，pH4.0～6.0；Phosphate，pH6.0～8.0；HEPES，pH7.0～8.0；Tricine，pH7.5～8.5；CHES，pH8.5～10.0）配制底物13 g/L可溶性淀粉溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)酶活力方法測(cè)定酶活力，以酶活力最高點(diǎn)作為100%。

pH值穩(wěn)定性：以不同pH值及不同體系的緩沖液將純酶稀釋適當(dāng)倍數(shù)，40℃保溫30 min，冰水浴冷卻30 min后于最適pH值條件下測(cè)定酶活力，以未處理的酶液作為對(duì)照，計(jì)算殘余酶活占對(duì)照的百分含量。

1.3.1.2 最適溫度及熱穩(wěn)定性

最適溫度測(cè)定：用50 mM pH 5.0 Citrate緩沖液配制底物，分別在不同溫度（50～80℃）下與底物反應(yīng)，按照標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定糖化酶的酶活力，以酶活力最高點(diǎn)為100%。

熱穩(wěn)定性：純酶用最適pH值體系適當(dāng)稀釋后于45～80℃保溫30 min，冰水浴冷卻30 min，采用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活力，以未處理的酶液作為對(duì)照，計(jì)算殘余酶活占對(duì)照的百分含量。

1.3.1.3 金屬離子和化合物對(duì)酶活的影響

糖化酶于50 mM pH 5.0的Citrate緩沖液中稀釋一定倍數(shù)，分別加入不同的金屬離子，使其終濃度為1 mM，將酶液在25℃下保溫30 min，在最適條件下測(cè)定糖化酶的殘余酶活力，以沒(méi)有添加金屬離子及化合物的酶液作為對(duì)照。

1.3.1.4 底物特異性

分別以可溶性淀粉、糯米淀粉、大米淀粉、糖原、支鏈淀粉、糊精、普魯蘭糖為底物測(cè)定其底物特異性，所有底物濃度均為1.3%（w/v），反應(yīng)條件為50 mM pH5.0 Citrate緩沖液，在70℃下反應(yīng)20 min后測(cè)定酶活。

1.3.1.5 水解特性

將濃度為10 mg/mL的可溶性淀粉、糯米淀粉、大米淀粉、支鏈淀粉，溶于50 mM pH 5.0 Citrate緩沖液中，酶添加量為2.0 U/mL，60℃水浴中反應(yīng)1 h，在不同時(shí)間（0、20 min、40 min和60 min）取樣。TLC條件：硅膠板（60 F 254，E.Merk，德國(guó)）在正丁醇-乙醇-水系統(tǒng)中展層2次，在表面均勻噴灑5%硫酸甲醇溶液，吹干并在130℃顯色；以麥芽寡糖混合物為標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 糖化酶（PtGA15）在黃酒中的應(yīng)用

采用如圖1所示的黃酒釀造工藝進(jìn)行黃酒發(fā)酵，并測(cè)定成品酒的理化指標(biāo)。

圖1 糖化酶在黃酒中的應(yīng)用

還原糖的測(cè)定采用DNS法[13]；酒精度、總酸、氨基態(tài)氮、pH值均按照《GB/T 13662—2008黃酒》[15]中的方法測(cè)定；干物質(zhì)含量的測(cè)定采用折射儀法[14]，葡萄糖值（Dextrose Equivalent，DE）[16]的計(jì)算公式如下：

1.3.2.1 糖化時(shí)間對(duì)糖化效果的影響

糯米經(jīng)液化處理后，迅速降溫至50℃，按150 U/g原料加入糖化酶PtGA15，保溫糖化，分別糖化30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210min、240min，取樣并迅速冷卻，稀釋后10000r/min離心3 min取上清液，測(cè)定上清液中還原糖含量及DE值隨時(shí)間的變化情況。

1.3.2.2 糖化階段糖化溫度的確定

糯米經(jīng)液化處理，迅速降溫至50℃，按150 U/g原料加入糖化酶PtGA15，分別在50℃、55℃、60℃下保溫糖化3 h，糖化完成后迅速冷卻，10000 r/min，離心3 min取上清液，并測(cè)定上清液中還原糖含量及DE值隨溫度的變化情況。

1.3.2.3 添加量對(duì)黃酒理化指標(biāo)的影響

分別按 0、50 U/g、100 U/g、150 U/g、200 U/g、300 U/g、400 U/g原料的量添加糖化酶PtGA15進(jìn)行黃酒釀造，于28～30℃前酵4 d，轉(zhuǎn)15℃后酵15 d，測(cè)定最終黃酒的殘?zhí)呛?、酒精度、氨基態(tài)氮、總酸等理化指標(biāo)，以確定糖化酶PtGA15的最佳添加量。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖化酶（PtGA15）的酶學(xué)性質(zhì)

2.1.1 最適pH值及其穩(wěn)定性

已報(bào)道的真菌來(lái)源糖化酶，多在酸性條件下保持穩(wěn)定，最適pH值大多集中在4.5～6.5[17-18]，pH值穩(wěn)定性范圍差別不大，與之前的研究相似，糖化酶PtGA15在pH4.5～6.5范圍內(nèi)酶活較穩(wěn)定。如圖2a所示，糖化酶PtGA15在pH5.0的檸檬酸緩沖液中，酶活性最高，在乙酸緩沖液中，pH5.5時(shí)酶活最高，但比在檸檬酸緩沖液中的酶活低了近10%；當(dāng)pH＞6時(shí)，酶活隨著pH值的升高而迅速降低。酶液在pH4.5～6.5之間時(shí)穩(wěn)定性最好，酶活穩(wěn)定性依然是在檸檬酸緩沖液中最高，在磷酸緩沖液中次之，并且發(fā)現(xiàn)在此pH值范圍內(nèi)處理30 min后，酶活力保持在80%以上（圖2b）。

圖2 糖化酶PtGA15最適pH值(a)及pH值穩(wěn)定性(b)

2.1.2 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

多數(shù)真菌來(lái)源的糖化酶在65～70℃時(shí)酶活最高，在65℃以?xún)?nèi)都能維持較好的酶活力[17-19]。結(jié)果表明，糖化酶PtGA15最適反應(yīng)溫度為70℃，在65～70℃范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的酶活力，在70℃時(shí)能保持90%以上的酶活（圖3a、圖3b）。

2.1.3 金屬離子及化合物對(duì)酶活力的影響（表1）

在 Marlida[20]、Kumar[21]及 Li[22]等的研究中發(fā)現(xiàn)，糖化酶活力對(duì)Ca2+表現(xiàn)出依賴(lài)性。然而，研究結(jié)果表明（表1），糖化酶PtGA15對(duì)金屬離子的敏感性一般，無(wú)明顯依賴(lài)性。除Li+對(duì)酶活有很弱的抑制作用外，金屬離子對(duì)其酶活都有一定的提高，其中Ba2+提高效果最大，為127.2%，Mg2+次之，為125.3%。另外DTT、EDTA、SDS存在時(shí)，其酶活力未受到明顯影響。

圖3 糖化酶PtGA15的最適溫度(a)和溫度穩(wěn)定性(b)

表1 金屬離子及部分試劑對(duì)糖化酶PtGA15酶活的影響

2.1.4 糖化酶PtGA15的底物特異性（表2）

表2 糖化酶PtGA15的底物特異性

如表2所示，糖化酶PtGA15對(duì)支鏈淀粉表現(xiàn)出較高的水解活性（184.8 U/mg），糯米和大米淀粉次之（169.5 U/mg），對(duì)糖原（135.7 U/mg）的水解能力比可溶性淀粉和土豆來(lái)源的糊精略低，對(duì)可溶性淀粉和糊精的水解活性無(wú)明顯差異，對(duì)普魯蘭酶的水解活性最低（43.1 U/mg）。

2.1.5 糖化酶PtGA15的水解特性分析（圖4）

糖苷水解酶對(duì)底物的水解能力主要受該酶對(duì)不同糖苷鍵水解能力高低的影響，相比其他底物，支鏈淀粉有更多的非還原末端和α-1,4-糖苷鍵，而糖化酶主要水解α-1,4-糖苷鍵[10，23]。如圖4所示，糖化酶PtGA15水解支鏈淀粉、大米淀粉、可溶性淀粉、糯米淀粉的產(chǎn)物通過(guò)TLC分析，發(fā)現(xiàn)糖化酶Pt-GA15對(duì)支鏈淀粉表現(xiàn)出較高的水解活性，對(duì)普魯蘭糖的水解活性最低，并且該酶水解各類(lèi)淀粉的產(chǎn)物唯一，為葡萄糖；而且在反應(yīng)一段時(shí)間后，當(dāng)溶液中僅有葡萄糖的情況下，反應(yīng)時(shí)間加長(zhǎng)，沒(méi)有其他高于葡萄糖的聚合度的高分子寡糖生成，說(shuō)明該酶轉(zhuǎn)糖苷能力很弱或沒(méi)有。

圖4 糖化酶PtGA15水解支鏈淀粉、大米淀粉、可溶性淀粉和糯米淀粉的TLC分析

2.2 糖化酶（PtGA15）在黃酒中的應(yīng)用

2.2.1 糖化時(shí)間的優(yōu)化（圖5）

圖5 糖化時(shí)間對(duì)糖化酶糖化效果的影響

由圖5可看出，當(dāng)糖化酶PtGA15的添加量為150 U/g原料，糖化時(shí)間為180 min時(shí)，糖化液的DE值達(dá)到最高，為115.1%，隨后DE值出現(xiàn)一定的下降，另外還原糖含量在120 min后沒(méi)有明顯的增加。適量的寡糖和還原糖為酵母細(xì)胞迅速生長(zhǎng)繁殖提供營(yíng)養(yǎng)，綜合DE值和還原糖含量情況確定最適的糖化時(shí)間為180 min。

2.2.2 糖化溫度的優(yōu)化（圖6）

由圖6可知，溫度能夠顯著影響酶促反應(yīng)。糖化180 min時(shí)，當(dāng)糖化溫度為50℃時(shí)，所得糖化液中還原糖含量最高，隨著糖化溫度上升，還原糖含量降低。糖化階段，糖化酶的熱穩(wěn)定性對(duì)其糖化能力有明顯的影響，糖化酶PtGA15在50～60℃內(nèi)，隨著溫度升高，酶的熱穩(wěn)定性降低，高于60℃后迅速失活，從而影響糖化水解能力。由于還原糖含量直接影響酵母生長(zhǎng)繁殖的速度，繼而影響發(fā)酵產(chǎn)酒精的能力，故確定糖化階段溫度為50℃。

圖6 糖化溫度對(duì)糖化酶糖化效果的影響

2.2.3 糖化酶（PtGA15）添加量的優(yōu)化（圖7）

圖7 糖化酶PtGA15加酶量對(duì)黃酒前酵階段酒精生成的影響

不同的糖化酶PtGA15添加量對(duì)黃酒理化指標(biāo)的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7和表3所示。發(fā)酵初期12 h內(nèi)所有樣品的酒精度都已經(jīng)占總的酒精產(chǎn)量的一半以上，而且加酶量越大，酒精度上升越快，發(fā)酵效率越高。由于液化和糖化同時(shí)進(jìn)行，α-淀粉酶和糖化酶之間存在明顯的協(xié)同作用，促進(jìn)還原糖含量的增加，經(jīng)酵母生長(zhǎng)繁殖及時(shí)消耗，底物抑制不明顯，酒精度含量上升速度與加酶量正相關(guān)。相比不加酶時(shí)發(fā)酵36 h后酒精度基本保持穩(wěn)定，加酶的樣品只需要24 h左右。

由表3可知，釀制的黃酒各項(xiàng)常規(guī)理化指標(biāo)達(dá)到傳統(tǒng)型國(guó)標(biāo)《GB/T 13662—2008黃酒》的要求。結(jié)果表明加酶量越大，殘還原糖含量越低，酒精度越高；加酶量為200 U/g原料時(shí)酒精度達(dá)16.6%vol，相比不加酶時(shí)的12.7%vol，提高了30.7%，隨后酒精度增長(zhǎng)減緩。另外，添加糖化酶PtGA15的黃酒，最終α-氨基態(tài)氮含量也較不加酶時(shí)明顯提高，150 U/g原料添加時(shí)提高最多，為32.7%。添加糖化酶PtGA15有利發(fā)酵的進(jìn)行，能夠提高發(fā)酵效率，增加原料利用率。加酶量為200 U/g原料時(shí)酒精度和α-氨基態(tài)氮含量相比300 U/g、400 U/g原料不存在顯著性差異，與Devantier等[24]、Shen等[25]的研究結(jié)果相近，故確定加酶量為200 U/g原料時(shí)，發(fā)酵效果最好。

3 結(jié)論

應(yīng)用糖化酶PtGA15于黃酒釀造，發(fā)現(xiàn)添加糖化酶PtGA15有利于發(fā)酵的進(jìn)行，能夠提高發(fā)酵效率，增加原料利用率。當(dāng)糖化溫度為50℃，糖化時(shí)間3 h時(shí)，糖化液中還原糖和干物質(zhì)含量最高；酶添加量為200 U/g原料時(shí)，各項(xiàng)指標(biāo)與添加量為300 U/g、400 U/g原料時(shí)不存在顯著性差異。添加糖化酶PtGA15生產(chǎn)的黃酒酒精度達(dá)16.6%vol，相比不加酶時(shí)的12.7%vol，提高了30.7%；與工廠(chǎng)樣品相比，酒精度有所上升，殘?zhí)呛柯愿撸琾H值和總酸含量略低，但綜合來(lái)說(shuō)相差不大，各項(xiàng)理化指標(biāo)均達(dá)到國(guó)標(biāo)《GB/T 13662—2008黃酒》的要求。生產(chǎn)中一般糖化工藝溫度控制在60～65℃，pH4.5左右，對(duì)酶的耐酸性及熱穩(wěn)定性有較高的要求，而糖化酶PtGA15不僅在pH4.5時(shí)具有較好的穩(wěn)定性，而且在50℃就表現(xiàn)出較高的酶活性，該酶應(yīng)用于生產(chǎn)，不僅對(duì)出酒率及黃酒品質(zhì)有所保證，同時(shí)還能起到節(jié)能減排的效果。

表3 糖化酶 PtGA15添加量對(duì)黃酒理化指標(biāo)的影響