高國棟， 張慶云， 易利， 李巖

天津市薊州區(qū)人民醫(yī)院 1預(yù)防保健部, 2泌尿外科(天津 301900)

前列腺癌是主要發(fā)生于中年和老年男性的惡性腫瘤，在全世界的發(fā)病率為25.3/10萬，位于男性所有惡性腫瘤的第2位[1]。富含半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich angiogenic inducer 61，Cyr61)是一種含有豐富半胱氨酸的分泌型基質(zhì)蛋白質(zhì)，由即刻反應(yīng)基因編碼，在CCN家族中第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)，又被稱為CCN1[2-3]。Cyr61具有廣泛的生物學(xué)功能，在組織再生、胚胎發(fā)育、炎癥、腫瘤等生理病理過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，與正常前列腺組織相比較，前列腺癌中Cyr61的表達(dá)水平發(fā)生變化，但是關(guān)于其變化趨勢(shì)的研究結(jié)果尚未統(tǒng)一，如Pilarsky等[4]發(fā)現(xiàn)Cyr61蛋白可在正常前列腺組織的上皮細(xì)胞中表達(dá)，而前列腺癌組織中Cyr61蛋白的表達(dá)明顯降低；D′Antonio等[5]則發(fā)現(xiàn)前列腺癌和前列腺上皮內(nèi)瘤中Cyr61蛋白的表達(dá)均顯著升高。Cyr61在前列腺癌中表達(dá)的變化仍有待研究，其作用機(jī)制尚不清楚，因此本研究旨在探討Cyr61在前列腺癌組織中的表達(dá)及其對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和自噬的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人前列腺癌PC-3細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；山羊血清封閉液、DAB顯色液、蘇木素、DAPI購于北京中杉金橋；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素、鏈霉素購于Gibco公司；Lipofectin-2000TM購于Invitrogen公司；序列合成于上海生工；抗Cyr61抗體、抗E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、抗波形蛋白抗體、抗LC-3Ⅱ抗體購于Santa Cruz公司；抗p-PI3K抗體、抗p-AKT抗體、抗GAPDH抗體購于Abcam公司；二抗購于武漢博士德；Trizol購于Solarbio公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購于Takara公司；MTT、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、上樣緩沖液、ECL顯色液購于上海碧云天。

1.2 組織的獲取與檢測(cè) 選取2016年5月至2018年9月期間于我院進(jìn)行手術(shù)治療的47例前列腺癌患者作為研究對(duì)象，所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)確診，排除術(shù)前已行放化療治療者、合并肝腎功能障礙或其他系統(tǒng)疾病者。一般資料：均為男性；年齡(68.25±6.74)歲；確診時(shí)平均前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)含量為(8.36±3.09)ng/mL；Gleason評(píng)分：高分化組(<7分)12例、中分化組(7～8分)25例、低分化組(>8分)10例。

收集手術(shù)切除的前列腺癌組織和癌旁正常組織，留取部分組織液氮速凍后保存于-80℃，以進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡試驗(yàn)(Western blot，WB)和熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，RT-PCR)；其余組織置于4%多聚甲醛中固定，以進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。

1.3 免疫組織化學(xué)染色 將4%多聚甲醛固定后的前列腺癌組織用石蠟包埋，切成厚度約為5 μm的切片，將切片放置于60℃恒溫箱中1 h以融化組織表面的蠟，常規(guī)脫蠟和水化，使用3%的H2O2溶液滅活內(nèi)源性的過氧化氫酶，將切片放于0.01 mol/L的枸櫞酸鈉緩沖液中進(jìn)行微波修復(fù)，10%的山羊血清封閉液室溫封閉20 min，滴加抗Cyr61抗體(1∶100)4℃過夜孵育。洗滌3次后，滴加二抗37℃孵育30 min，洗滌3次，滴加DAB顯色液，自來水沖洗干凈后進(jìn)行蘇木素復(fù)染，最后經(jīng)脫水、透明、樹膠封片后進(jìn)行鏡檢和拍照。

1.4 質(zhì)粒的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 參照付鵬等[6]的研究合成Cyr61的小干擾RNA (siCyr61)和無關(guān)序列 (siControl)，見表1。將上述單鏈寡核苷酸片段用退火緩沖液溶解，95℃水浴退火5 min以形成雙鏈，使用基因工程的方法將其構(gòu)建至pGenesil-1.1質(zhì)粒的BamHⅠ酶切位點(diǎn)和HindⅢ酶切位點(diǎn)間，DNA測(cè)序驗(yàn)證序列是否正確。使用Lipofectin-2000TM將測(cè)序正確的siControl質(zhì)粒和siCyr61質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至PC-3細(xì)胞，分別使用qRT-PCR和WB檢測(cè)細(xì)胞中Cyr61 mRNA和蛋白的表達(dá)。

表1 小干擾RNA的序列

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 將PC-3細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。將PC-3細(xì)胞隨機(jī)分為3組，分別為空白組、siControl組和siCyr61組。siControl組使用siControl質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，siCyr61組使用siCyr61質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，空白組使用PBS作為轉(zhuǎn)染對(duì)照。

轉(zhuǎn)染48 h后，使用qRT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中Cyr61 mRNA的表達(dá)，使用WB檢測(cè)細(xì)胞中Cyr61、E-cadherin、波形蛋白(Vimentin)、p-PI3K、p-AKT蛋白的表達(dá)，使用免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞中LC-3Ⅱ的表達(dá)。使用MTT試驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后24 h、48 h和72 h時(shí)的細(xì)胞增殖情況。

1.6 免疫熒光染色 將PC-3細(xì)胞以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種至24孔板，按照上述方法將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、siControl組和siCyr61組，并進(jìn)行相應(yīng)的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，吸棄上清液，洗滌細(xì)胞，使用抗LC-3Ⅱ抗體(1∶50)4℃過夜孵育。洗滌后，加入偶聯(lián)FITC的山羊抗兔二抗，室溫避光孵育1 h，洗滌后，加入DAPI溶液室溫避光孵育30 min，洗滌，熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.7 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 將PC-3細(xì)胞以每孔4×103個(gè)細(xì)胞接種至96孔板，按照上述方法將細(xì)胞隨機(jī)分為空白組、siControl組和siCyr61組，并進(jìn)行相應(yīng)的轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后24、48和72 h時(shí)，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入180 μL的無血清培養(yǎng)液和20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，繼續(xù)于37℃培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液后每孔加入150 μL的DMSO，震蕩10 min，使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔的光密度值(OD值)。

1.8 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 使用RT-PCR檢測(cè)前列腺癌組織和癌旁組織中Cyr61 mRNA的表達(dá)，使用RT-PCR檢測(cè)空白組、siControl組和siCyr61組PC-3細(xì)胞中Cyr61 mRNA的表達(dá)。Trizol法提取組織和細(xì)胞中的總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min,58℃退火1 min，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)。取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀下觀察和拍照。使用Quantity One軟件測(cè)定各條帶的灰度值，將目的基因與內(nèi)參基因GAPDH的灰度值之比作為1。

所用引物為：Cyr61上游引物：5′-CTCGCCTTAGTCGTCACCC-3′，下游引物：5′-CGCCGAAGTTGCATTCCAG-3′；GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.9 蛋白質(zhì)免疫印跡 使用WB檢測(cè)前列腺癌組織和癌旁組織中Cyr61蛋白的表達(dá)，使用WB檢測(cè)空白組、siControl組和siCyr61組PC-3細(xì)胞中Cyr61、E-cadherin、Vimentin、p-PI3K和p-AKT的表達(dá)。加入含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液充分裂解細(xì)胞和組織，組織需要同時(shí)進(jìn)行勻漿才可充分裂解，12 000×g離心5 min，取上清液進(jìn)行BCA蛋白定量。取40 μg的總蛋白，加入上樣緩沖液后，沸水中煮5 min，以充分變性，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%的牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入抗Cyr61抗體(1∶500)、抗E-cadherin抗體(1∶1 000)、抗Vimentin抗體(1∶1 000)、抗p-PI3K抗體(1∶500)、抗p-AKT抗體(1∶500)和抗GAPDH抗體(1∶3 000)4℃過夜。洗滌3次，加入二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，洗滌3次，滴加ECL顯色液，凝膠成像儀下觀察和拍照。使用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)定各條帶的灰度值，將目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值之比作為1。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件，所有計(jì)量數(shù)據(jù)均表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，3組間計(jì)量數(shù)據(jù)的比較使用單因素方差分析，兩組間計(jì)量數(shù)據(jù)的比較使用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)Cyr61在前列腺癌組織中的表達(dá) Cyr61在前列腺癌旁組織中呈陰性或低表達(dá)，而在前列腺癌組織中的表達(dá)水平明顯升高，顯示為棕黃色顆粒，見圖1。

A：癌旁組織; B：前列腺癌組織

2.2 RT-PCR和WB檢測(cè)前列腺癌組織中Cyr61 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá) 與癌旁組織相比較，前列腺癌組織中Cyr61 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2和表2。

A:RT-PCR檢測(cè)；B:WB檢測(cè)

表2Cyr61mRNA和蛋白質(zhì)在前列腺癌組織和癌旁組織中表達(dá)的比較

項(xiàng)目例數(shù)Cyr61 mRNACyr61蛋白質(zhì)癌旁組織471.00±0.211.00±0.18前列腺癌組織473.73±0.693.05±0.54t值25.95024.690P值<0.001<0.001

2.3 RT-PCR和WB檢測(cè)人前列腺癌細(xì)胞中Cyr61 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá) 與空白組和siControl組相比較，siCyr61組細(xì)胞中Cyr61 mRNA和蛋白質(zhì)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3和表3。

2.4 沉默Cyr61對(duì)人前列腺癌細(xì)胞增殖的影響 與空白組和siControl組相比較，siCyr61組細(xì)胞在培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)OD值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

A:RT-PCR檢測(cè)；B:WB檢測(cè)

表33組細(xì)胞中Cyr61mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的比較

項(xiàng)目nCyr61 mRNACyr61蛋白質(zhì)空白組101.00±0.221.00±0.16siControl組101.04±0.240.93±0.20siCyr61組100.23±0.11?△0.29±0.14?△F值52.95053.910P值<0.001<0.001

*與空白組比較P<0.05；△與siControl組比較P<0.05

2.5 沉默Cyr61對(duì)人前列腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響 與空白組和siControl組相比較，siCyr61組細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)明顯升高，Vimentin的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4和表5。

表43組細(xì)胞間細(xì)胞增殖的比較(OD值)

項(xiàng)目n24 h48 h72 h空白組100.493±0.0290.872±0.0451.406±0.110siControl組100.487±0.0340.880±0.0561.413±0.122siCyr61組100.328±0.031?△0.562±0.033?△0.774±0.051?△F值88.810157.800136.500P值<0.001<0.001<0.001

*與空白組比較P<0.05；△與siControl組比較P<0.05

圖4 WB檢測(cè)PC-3細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.6 沉默Cyr61對(duì)人前列腺癌細(xì)胞自噬的影響 與空白組和siControl組相比較，siCyr61組細(xì)胞中LC-3Ⅱ的熒光強(qiáng)度較高，見圖5。

項(xiàng)目nE-cadherinVimentin空白組101.00±0.241.00±0.21siControl組100.96±0.201.05±0.27siCyr61組102.75±0.46?△0.28±0.13?△F值101.40041.590P值<0.001<0.001

*與空白組比較P<0.05；△與siControl組比較P<0.05

圖5 免疫熒光染色檢測(cè)PC-3細(xì)胞LC-3Ⅱ的表達(dá)(×200)

2.7 沉默Cyr61對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的影響 與空白組和siControl組相比較，siCyr61組細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6和表6。

3 結(jié)論

Cyr61是CCN家族的細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、黏附、遷移、血管生成、腫瘤生長(zhǎng)、胚胎發(fā)生等廣泛作用。研究發(fā)現(xiàn)，Cyr61蛋白過量表達(dá)于乳腺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等多種類型腫瘤，可作為潛在的預(yù)后指標(biāo)和治療靶點(diǎn)，但是其在子宮肌瘤、非小細(xì)胞肺癌等部分腫瘤中卻表達(dá)下調(diào)，上調(diào)Cyr61表達(dá)能夠抑制肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[7-8]。Cyr61在前列腺癌中的相關(guān)報(bào)道也有很多不一致之處，如Terada等[9]認(rèn)為Cyr61在前列腺癌患者的血清和組織中高表達(dá)，其血清中含量的測(cè)定可用于判斷前列腺癌患者的預(yù)后；而Lee等[10]卻發(fā)現(xiàn)在N-乙酰半胱氨酸抑制前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖的實(shí)驗(yàn)中伴隨著Cyr61表達(dá)的顯著升高。因此，Cyr61在前列腺癌中的表達(dá)變化和具體作用需要進(jìn)一步研究。

圖6 WB檢測(cè)PC-3細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

項(xiàng)目np-PI3Kp-AKT空白組101.00±0.221.00±0.19siControl組100.97±0.201.07±0.23siCyr61組100.31±0.14?△0.26±0.10?△F值42.25061.040P值<0.001<0.001

*與空白組比較P<0.05；△與siControl組比較P<0.05

本文收集了手術(shù)切除的前列腺癌組織和癌旁正常組織，對(duì)組織中Cyr61的表達(dá)進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示Cyr61在前列腺癌旁組織中呈陰性或低表達(dá)，而在前列腺癌組織中則呈棕黃色的陽性表達(dá)。RT-PCR和WB的結(jié)果也顯示前列腺癌組織中Cyr61 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)量較癌旁組織升高。因此，本文認(rèn)為Cyr61在前列腺癌患者的癌組織中高表達(dá)，部分報(bào)道與本研究結(jié)果不一致的原因可能在于樣本來源、檢測(cè)指標(biāo)、樣本數(shù)量等不同。

本文將構(gòu)建的Cyr61干擾序列和對(duì)照序列轉(zhuǎn)染至人前列腺癌PC-3細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞中Cyr61 mRNA和蛋白質(zhì)明顯降低，表明Cyr61的小分子干擾RNA構(gòu)建成功。MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組和siControl組相比較，siCyr61組細(xì)胞在培養(yǎng)24、48和72 h時(shí)OD值明顯降低，表明Cyr61沉默后可以抑制人前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖。Cyr61對(duì)大部分細(xì)胞均具有促增殖效應(yīng)，如Cyr61可以通過整合素αⅤβ3受體促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)化療藥物抵抗[11]。但是Cyr61對(duì)部分細(xì)胞也具有抑制效應(yīng)，如Cyr61可以與成纖維細(xì)胞的整合素α6β1受體結(jié)合，誘導(dǎo)p53依賴的細(xì)胞凋亡[12-13]。因此，本文認(rèn)為Cyr61對(duì)不同細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)的差異性可能與細(xì)胞類型以及作用受體有關(guān)。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指上皮細(xì)胞逐漸失去上皮特性，并且獲得間質(zhì)特征，遷移和侵襲能力增強(qiáng)，是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中關(guān)鍵的起始過程。大量研究證實(shí)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與前列腺癌的遷移和侵襲，靶向抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中關(guān)鍵的信號(hào)通路具有良好的腫瘤治療效應(yīng)[14]。E-cadherin是上皮細(xì)胞的標(biāo)志物，波形蛋白是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，它們表達(dá)水平的變化可以反映上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的程度[15]，因此本文對(duì)這兩個(gè)分子的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示與空白組和siControl組相比較，siCyr61組細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)明顯升高，波形蛋白的表達(dá)明顯降低，表明Cyr61沉默可以抑制前列腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

自噬是一種細(xì)胞降解途徑，主要表現(xiàn)為在炎癥、饑餓、生長(zhǎng)因子剝奪等應(yīng)激環(huán)境下，細(xì)胞器等成分被吞噬、消化、再循環(huán)以維持細(xì)胞的新陳代謝，也參與病原體清除、凋亡細(xì)胞吞噬等病理過程。自噬水平的下調(diào)可以促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，使用藥物等方法上調(diào)自噬水平可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[16-17]。LC-3Ⅱ是自噬的標(biāo)志物[17]，因此本文對(duì)LC-3Ⅱ的表達(dá)進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示與空白組和siControl組相比較，siCyr61組細(xì)胞中LC-3Ⅱ的熒光強(qiáng)度較高，表明Cyr61沉默可以誘導(dǎo)LC-3Ⅱ的表達(dá)，上調(diào)自噬水平。

PI3K/AKT信號(hào)通路的激活在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、凋亡的抑制、血管形成、遷移和侵襲等，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路可以降低前列腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，增強(qiáng)化療藥物治療的敏感性[18]。本文結(jié)果顯示，與空白組和siControl組相比較，siCyr61組細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT的表達(dá)明顯降低，表明Cyr61沉默可以抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，可能是Cyr61沉默抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制。

本研究的不足：(1)作為一種促血管生成因子，Cyr61誘導(dǎo)的血管生成在各種腫瘤的形成與進(jìn)展中發(fā)揮重要的病理作用[19]，但是本研究未對(duì)Cyr61在前列腺癌血管生成中的作用進(jìn)行探討；(2)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的侵襲性，本研究發(fā)現(xiàn)Cyr61沉默可以降低上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)，但是Cyr61是否進(jìn)一步影響前列腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力尚不清楚；(3)本研究使用體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)探討Cyr61在前列腺中的作用，但是相關(guān)結(jié)論尚缺乏體內(nèi)動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，Cyr61在前列腺癌患者的癌組織中高表達(dá)，使用RNA干擾將Cyr61沉默后可以抑制人前列腺癌PC-3細(xì)胞的增殖，降低上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)自噬的發(fā)生，可能與對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制有關(guān)。