陳肖珍，張 瑩

(廣東省深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，廣東深圳 518106)

山藥(Rhizomadioscoreae)是薯蕷科薯蕷屬植物薯蕷(DioscoreaoppositeThunb.)的根莖，其味甘、性平，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精等功效，屬于藥食同源之上品[1]，具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值均高的優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，山藥含有蛋白質(zhì)、氨基酸、多糖、尿囊素、皂苷等活性成分。由于皮膚中的多糖廣泛參與細(xì)胞活動(dòng)而產(chǎn)生多種生物學(xué)功能，如增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、抗輻射和延緩衰老等[2]。本文研究了山藥多糖的吸濕、保濕性能及體外透皮吸收特性，為其相關(guān)的功能性產(chǎn)品開發(fā)及應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 Shimadzu UV-2700型紫外分光光度計(jì)[島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司]；YB-P6智能透皮實(shí)驗(yàn)儀(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)；DL-720E超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；UPH-Ⅰ超純水機(jī)(成都超純科技有限公司)；BS-224S型分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科技有限公司)。

1.2 藥品和試劑 懷山藥(批號(hào)180110，廣州至信中藥飲片有限公司)；D-無水葡萄糖對(duì)照品(批號(hào)110833-201506，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；海藻酸鈉(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司)；甘油(天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠)；微粉硅膠(安徽山河藥用輔料股份有限公司)；其他試劑均為分析純；水為超純水(廣東省深圳市光明新區(qū)人民醫(yī)院自制)。

1.3 動(dòng)物 SD大鼠，體質(zhì)量(200±10) g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào):SYXK(粵)2017-0125。

2 方法和結(jié)果

2.1 山藥多糖的制備[3]將懷山藥烘干、粉碎，過60目篩，稱取100 g，用5倍量的95%乙醇加熱回流提取3次，每次1.5 h，去掉上清液，收集濾渣。濾渣加入水，100 ℃加熱提取3次，每次2 h，將提取液離心(相對(duì)離心力2.26×103×g)，取上清液濃縮至1 g生藥/ml，加入95%乙醇沉淀，在4 ℃冰箱靜置12 h，離心(相對(duì)離心力1.37×103×g)，沉淀依次用95%乙醇、丙酮、乙醚各100 ml攪拌、抽濾，將沉淀冷凍干燥，得到山藥多糖。

2.2 吸濕性實(shí)驗(yàn)[4，5]將山藥多糖、甘油和海藻酸鈉烘干至恒重，室溫下分別準(zhǔn)確稱取0.5 g，每個(gè)樣品做3份平行操作，置直徑3 cm的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿分別置3個(gè)干燥器中，溫度(23±1) ℃，干燥器內(nèi)分別放有已放置6 h的飽和乙酸鉀溶液(相對(duì)濕度43%)和飽和硫酸銨溶液(相對(duì)濕度81%)，放置1、2、4、6、8、12、16、24、36、48 h，分別稱量樣品放置前質(zhì)量(w0)和放置后質(zhì)量(wm)。按以下公式計(jì)算吸濕率：吸濕率= [(wm-w0)/w0]×100%。

2.2.1 在相對(duì)濕度43%環(huán)境中的吸濕率 山藥多糖、甘油和海藻酸鈉在相對(duì)濕度43%環(huán)境中的吸濕率見圖1A。由圖1A可見，在0～2 h內(nèi)，山藥多糖與海藻酸鈉的吸濕率基本一致，2 h后增速變化明顯；在0～48 h內(nèi)的吸濕率，甘油>山藥多糖>海藻酸鈉，甘油的吸濕率比山藥多糖和海藻酸鈉都上升更快，而山藥多糖的吸濕率比海藻酸鈉上升更快。

2.2.2 在相對(duì)濕度81%環(huán)境中的吸濕率 山藥多糖、甘油和海藻酸鈉在相對(duì)濕度81%環(huán)境中的吸濕率見圖1B。由圖1B可見，在1～4 h內(nèi)，海藻酸鈉和山藥多糖的吸濕率表現(xiàn)出較一致的勻速上升趨勢(shì)，4 h后山藥多糖則上升更為明顯。0～48 h內(nèi)的吸濕率由大到小排列依次是甘油、山藥多糖、海藻酸鈉，甘油的吸濕率快速上升，而山藥多糖和海藻酸鈉上升則較緩慢。

圖1 山藥多糖、甘油和海藻酸鈉的吸濕率變化Figure 1 Changes of moisture absorption rates ofyam polysaccharides，glycerol and sodium alginateA：相對(duì)濕度43%；B：相對(duì)濕度81%；○：甘油；●：海藻酸鈉；△：山藥多糖；n=3

2.3 保濕性實(shí)驗(yàn)[4，5]將山藥多糖、甘油和海藻酸鈉烘干至恒重，室溫下分別準(zhǔn)確稱取0.5 g，加入超純水配制成濃度20%的水溶液，涂布于直徑6 cm培養(yǎng)皿底部的透氣膠帶上，每個(gè)樣品平行操作3份。將培養(yǎng)皿置于放有干微粉硅膠的干燥器中，溫度(23±1) ℃，放置1、2、4、6、8、12、16、24、36、48 h，分別稱量樣品放置前的水分質(zhì)量(m0)和放置后水分質(zhì)量(mm)。按以下公式計(jì)算保濕率：保濕率=(mm/m0)×100%。山藥多糖、甘油和海藻酸鈉在干微粉硅膠環(huán)境中的保濕率見圖2。由圖2可見，0～48 h內(nèi)保濕率由大到小排列順序?yàn)樯剿幎嗵恰⒑Ｔ逅徕c、甘油。在0～2 h內(nèi)，三者保濕率的下降趨勢(shì)基本一致，之后甘油的保濕率呈現(xiàn)快速下降趨勢(shì)，在24 h后開始變緩慢。

圖2 山藥多糖、甘油和海藻酸鈉在干微粉硅膠環(huán)境中保濕率的變化Figure 2 Changes of moisture retention rates of yam polysaccharides，glycerol and sodium alginate in the dry environment created by dry micronized silica gel○：甘油；●：海藻酸鈉；△：山藥多糖；n=3

2.4 山藥多糖的含量測(cè)定[6]

2.4.1 溶液的配制 (1)對(duì)照品溶液：稱取D-無水葡萄糖對(duì)照品適量，加超純水配制成濃度0.103 0 mg/ml的山藥多糖對(duì)照品溶液。(2)供試品溶液：稱取2.1項(xiàng)下的山藥多糖適量，加超純水配制成濃度0.202 6 mg/ml的供試品溶液。

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取2.4.1項(xiàng)下的山藥多糖對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml置試管中，補(bǔ)充超純水至1.0 ml，再加入5%苯酚溶液1.0 ml，搖勻后緩慢加入濃硫酸5.0 ml，沸水浴15 min，取出后在冰水中冷卻至室溫。另取超純水1.0 ml作為空白對(duì)照，同法操作。采用紫外-可見分光光度法，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)。以A為縱坐標(biāo)，葡萄糖的濃度(c)為橫坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程A=0.067c+0.029(r=0.999 8)，結(jié)果表明D-無水葡萄糖在1.47～14.72 μg/ml范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.4.1項(xiàng)下的山藥多糖對(duì)照品溶液0.4 ml，按2.4.2項(xiàng)下操作進(jìn)行顯色反應(yīng)，用紫外-可見分光光度計(jì)在490 nm波長(zhǎng)處連續(xù)測(cè)定6次吸光度，計(jì)算得到吸光度的RSD=0.94%(n=6)，表明精密度良好。

2.4.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取6份已知含量的供試品溶液各0.3 ml，分別加入濃度0.103 0 mg/ml的D-無水葡萄糖對(duì)照品溶液0.2 ml，混勻，按照2.4.2項(xiàng)下方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，用紫外-可見分光光度計(jì)在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算平均加樣回收率為99.13%，RSD=1.89%(n=6)，表明該法準(zhǔn)確性良好。

2.5 體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)[7]

2.5.1 離體皮膚的制備 將SD大鼠脫頸處死，用剃須刀機(jī)械脫毛，取腹部皮膚，刮去皮下脂肪和黏連物，用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，選擇完整皮膚剪成適當(dāng)大小，置密封塑料袋中，放入-70 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5.2 透皮吸收實(shí)驗(yàn) 將大鼠皮膚固定于Franz擴(kuò)散池的給藥室與接收室之間，接收室內(nèi)徑1.8 cm，總?cè)莘e17 ml，使皮膚表層面向給藥室，真皮一側(cè)與接收液接觸，同時(shí)將氣泡排凈。吸取濃度10%的山藥多糖溶液1.0 ml，置于給藥室中，與皮膚密切接觸。接收液為生理鹽水，用磁轉(zhuǎn)子300 r/min攪拌，水浴溫度為37 ℃。在水浴溫度達(dá)到預(yù)設(shè)溫度時(shí)開始計(jì)時(shí)，分別于1、2、4、6、8、10、12、18、24 h取樣，每次取樣1.0 ml，同時(shí)向接收室補(bǔ)充等體積同溫度的接收液。按2.4.2項(xiàng)下方法處理接收液樣品，用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，計(jì)算山藥多糖的含量，按以下公式計(jì)算累積滲透量(Q)。

式中，cm為第m個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物濃度(μg/ml)，V為接收液體積(17 ml)，ci為第i個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物濃度(μg/ml)，Vi為取樣體積，A表示釋藥面積(cm2)。以單位面積的滲透量為縱坐標(biāo)，滲透時(shí)間(t)為橫坐標(biāo)，繪制累積滲透曲線，所得直線斜率為穩(wěn)態(tài)透皮速率(JS，μg·cm-2·h-1)，見圖3。由圖3可見，在0～24 h內(nèi)，濃度10%的山藥多糖溶液勻速緩慢滲透，JS為12.46 μg·cm-2·h-1，累積滲透率為1.87%。在前12 h內(nèi)，山藥多糖溶液的滲透速率上升較快，12 h后則較平緩。Q=1.460t+10.61(r=0.976 2)，JS=1.460 μg·cm-2·h-1，24 h的累積滲透率為(1.87±0.31)%。

圖3 10%山藥多糖溶液的透皮吸收曲線Figure 3 Transdermal absorption curve of 10% yam polysaccharide solution

2.5.3 鼠皮中藥物滯留量的測(cè)定 體外透皮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，取下鼠皮，沖洗干凈，選取有效透皮部分(直徑1.8 cm的圓形)，剪碎后加入一定量生理鹽水，50 ℃超聲(功率300 W)30 min，過濾后將溶液定容至100 ml。吸取1 ml溶液，按2.4.2項(xiàng)下方法處理，用紫外-可見分光光度計(jì)在490 nm測(cè)定吸光度，計(jì)算山藥多糖的含量，同時(shí)按以下公式計(jì)算滯留率。滯留率=Q滯留量/Q總量×100%。結(jié)果顯示，鼠皮中山藥多糖的滯留量為(193.98±31.71) μg，滯留率為(0.60±0.10)%(n=3)。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)， 在相對(duì)濕度43%和81%的環(huán)境下，山藥多糖24 h的吸濕率分別為37.6%和48.4%，48 h的吸濕率分別為40.2%和55.3%，表明隨著相對(duì)濕度上升，其吸濕率提高。山藥多糖的吸濕性比甘油弱，但強(qiáng)于海藻酸鈉。在干微粉硅膠營(yíng)造的干燥環(huán)境中，山藥多糖24 h和48 h的保濕率分別為24.8%和16.5%，其保濕性優(yōu)于甘油和海藻酸鈉。在體外，山藥多糖的累積滲透速率為1.460 μg·cm-2·h-1，24 h累積滲透率為(1.87±0.31)%，在鼠皮中的滯留率為(0.60±0.10)%，表明其能夠緩慢地經(jīng)皮滲透，預(yù)示透皮吸收性能良好。山藥多糖的吸濕性和保濕性與茯苓多糖[4]、金蕎麥多糖[5]接近。本研究結(jié)果提示，綜合考慮山藥多糖的吸濕性、保濕性和透皮吸收性，可將其用于護(hù)膚保濕劑和創(chuàng)傷修復(fù)貼劑的開發(fā)應(yīng)用。