周春娜，陳 磊，卞艷芳，李 玲

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院分析測試中心，上海 200433)

墨旱蓮為菊科一年生草本植物鱧腸(EcliptaprostrataL.)的全草[1]，其味甘、酸，性寒，歸腎、肝經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎，涼血止血之功，主產(chǎn)浙江、廣東、湖北、廣西等地，其主要成分包括三萜類、香豆草醚類、黃酮類、甾體類、噻吩類和揮發(fā)油等物質(zhì)，具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)、保肝、抗纖維化、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[2]。植物代謝組學(xué)從宏觀角度研究植物的生理生化過程，研究植物在特定條件下的代謝表型以及這些表型與基因型之間的聯(lián)系。采用高通量檢測和數(shù)據(jù)處理對植物中低分子量物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析，可以更科學(xué)、全面地反映中藥化學(xué)成分由于品種、生長環(huán)境和炮制方法等因素的影響而發(fā)生的變化，為中藥現(xiàn)代化的深入研究提供了新的技術(shù)手段[3]。目前代謝組學(xué)的研究方法主要有GC-MS法、核磁共振技術(shù)(NMR)、LC-MS法等。其中，基于GC-MS法的代謝分析平臺(tái)具有高靈敏度、高分離能力以及商品化的代謝物標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫等優(yōu)勢，已廣泛地應(yīng)用于植物代謝組學(xué)研究中[4]。如用GC-MS法對擬南芥、玉米、水稻等植物的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，為植物的代謝多樣性研究提供了參考依據(jù)[5,6]。本研究以墨旱蓮為研究對象，開展了基于衍生化GC-MS法的植物代謝輪廓分析，利用質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行定性鑒別，并采用主成分分析(principal component analysis，PCA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行模式識(shí)別，為墨旱蓮代謝組學(xué)的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材 料

1.1 儀器 Thermo Trace GC Ultra & DSQII氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、FRESCO臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國賽默飛世爾公司)；METTLER AE 240型電子天平(瑞士梅特勒公司，精度：0.1 mg)；LX-02藥材粉碎機(jī)(上海利祥公司)；DZG-6020真空干燥箱(上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器公司)。METLAB軟件(美國MathWords公司)；SIMCA-P V11.0軟件(瑞典Umetrics公司)。

1.2 試藥 甲氧基胺鹽酸鹽(methoxyamine hydrochioride)、吡啶(pyridine)、N-甲基-N-(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(MSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)、核糖醇(ribitol)購自Sigma Aldrich公司；甲醇(色譜純，德國默克公司)；氯仿、正庚烷(分析純，上海國藥試劑公司)；水為娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán))。

墨旱蓮分別采自3個(gè)不同產(chǎn)地和4個(gè)不同時(shí)間，見表1。由海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院賈敏副教授鑒定為墨旱蓮。實(shí)驗(yàn)從不同產(chǎn)地和不同采收時(shí)間兩個(gè)層面進(jìn)行墨旱蓮代謝輪廓分析，每組分別取6 個(gè)單獨(dú)的植株作為重復(fù)，于-80 ℃冰箱保存。

表1 墨旱蓮的采收時(shí)間、產(chǎn)地及分組Table 1 Harvest time,origins and grouping of Ecliptae Herba

2 方 法

2.1 樣品的提取 取保存在-80 ℃冰箱中的墨旱蓮，置于研缽中，液氮冷凍下充分研磨后，精密稱取50.0 mg，置于2 ml離心管中，加入濃度為0.2 mg/ml的內(nèi)標(biāo)核糖醇水溶液50 μl(精密稱取核糖醇對照品10.0 mg，溶于50 ml純凈水中)及1.5 ml提取溶劑(甲醇∶氯仿∶水=3∶1∶1)，超聲提取20 min，隨后于4 ℃下1.68×104×g離心5 min，取上清液1 ml，加純凈水500 μl，渦旋混合10 s，1.5×103×g離心5 min，取上層水相500 μl，冷凍干燥，備用。每組取等量的上清液混合，作為質(zhì)控樣品(QC)。

2.2 樣品的衍生化 冷凍干燥后的樣品中加入濃度為15 mg/ml的甲氧胺吡啶溶液50 μl(精密稱取甲氧基胺鹽酸鹽30.0 mg，溶于2 ml吡啶中)，渦旋30 s，于30 ℃振蕩反應(yīng)90 min，加入100 μl MSTFA(含1%的TMCS)，渦旋30 s， 37 ℃振蕩反應(yīng)30 min，再加入200 μl正庚烷，渦旋30 s，1.5×103×g離心5 min，取上清液100 μl至進(jìn)樣小瓶。

2.3 色譜和質(zhì)譜條件 采用Agilent DB-5MS UI 氣相色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，分流比10∶1，進(jìn)樣口溫度260 ℃，程序升溫：起始溫度70 ℃，以5 ℃/min的速率升溫至160 ℃，然后以3 ℃/min升至220 ℃并保持2 min，再以10 ℃/min 的速率升至300 ℃，并保持10 min，傳輸線溫度260 ℃，載氣為高純氦氣，流速1 ml/min，進(jìn)樣量1 μl。質(zhì)譜采用電子轟擊離子源，溫度為200 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍(m/z)：40～600，溶劑延遲時(shí)間：4 min。

2.4 穩(wěn)定性考察 由于植物代謝物的成分復(fù)雜，為確保實(shí)驗(yàn)過程中系統(tǒng)的穩(wěn)定性，用QC樣品進(jìn)行監(jiān)測，以保留時(shí)間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)來表示。本研究中采用了三階段的程序升溫，在每一個(gè)升溫階段隨機(jī)選取了3個(gè)色譜峰的提取離子進(jìn)行系統(tǒng)穩(wěn)定性考察，色譜峰保留時(shí)間的RSD為0.003%～0.088%，峰面積的RSD為2.06%～7.97%，結(jié)果表明系統(tǒng)穩(wěn)定，該方法適合于后續(xù)樣品的分析。

2.5 樣品測定 在優(yōu)化的GC-MS條件下，對不同產(chǎn)地和不同采收時(shí)間的墨旱蓮樣品進(jìn)行測定，得到的總離子流圖見圖1。所得的數(shù)據(jù)經(jīng)NIST數(shù)據(jù)庫比對，去硅烷基，還原化合物中的活潑氫，進(jìn)行定性分析，結(jié)果鑒別了38 種化合物(見表2)，其中包括18種有機(jī)酸類、3種氨基酸類、8種糖類、8種醇類、1種其他類成分。

圖1 墨旱蓮初級(jí)代謝產(chǎn)物的GC-MS總離子流譜圖Figure 1 GC-MS total ion chromatogram of primary metabolites of Ecliptae Herba

2.6 數(shù)據(jù)處理 將原始數(shù)據(jù)經(jīng)Xcalibur File converter工具轉(zhuǎn)換為通用的CDF格式，轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)一步通過R軟件、XCMS程序包進(jìn)行峰校正和積分，最終得到一個(gè)保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度的三維數(shù)據(jù)矩陣，然后用METLAB軟件進(jìn)行中心化和歸一化。將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P V11.0軟件進(jìn)行PCA，根據(jù)相關(guān)R2、Q2值對模型進(jìn)行評價(jià)。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，比較多組間平均值的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 墨旱蓮代謝產(chǎn)物的GC-MS定性分析結(jié)果Table 2 Analysis results of metabolites of Ecliptae Herba by GC-MS method

2.7 PCA 墨旱蓮的極性代謝產(chǎn)物GC-MS總離子流圖經(jīng)Xcalibur File converter格式轉(zhuǎn)換，通過XCMS提取校正，為了簡化數(shù)據(jù)矩陣，對保留時(shí)間相同(保留兩位小數(shù))的離子進(jìn)行無靶標(biāo)的篩選(即在同一保留時(shí)間下，只保留峰強(qiáng)度最大的離子)，最終得到189個(gè)離子。將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P V11.0軟件，采用無監(jiān)督的PCA法，呈現(xiàn)數(shù)據(jù)的自然分布特征，結(jié)果見圖2。

圖2 墨旱蓮極性代謝產(chǎn)物主成分分析得分圖Figure 2 Score plot of polarity metabolites of Ecliptae Herba analyzed by principal component analysisa:于2016年9月采自湖南長沙；b:于2016年9月采自湖北襄樊；c:于2016年8月采自廣西桂林；d:于2016年9月采自廣西桂林；e:于2016年10月采自廣西桂林；f:于2016年11月采自廣西桂林

2.8 不同產(chǎn)地的墨旱蓮代謝物分析 對相同采收時(shí)間不同產(chǎn)地的墨旱蓮代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3 A。3組樣本得到了明顯的區(qū)分，而且所建立的模型R2X、R2Y、Q2分別為0.944、0.946、0.930，表明模型具有良好的預(yù)測能力和可靠性。根據(jù)主成分載荷因子可知何種代謝物對分類貢獻(xiàn)最大，見圖4A。載荷圖上每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)變量，離原點(diǎn)距離越遠(yuǎn)，表明該成分含量變化對分組的貢獻(xiàn)越大。通過合并來自同一化合物的變量，最終得到8個(gè)具有分組意義的變量，分別是琥珀酸、丙三醇、蘋果酸、L-脯氨酸、4,6-二羥基-2-巰基嘧啶、葡萄糖、肌醇、十八烷酸，其相對含量見圖5。

圖3 不同產(chǎn)地和不同采收時(shí)間的墨旱蓮代謝產(chǎn)物的主成分分析得分圖Figure 3 Score plot of metabolites of Ecliptae Herba analyzed by principal component analysis based on different origins and different harvest timeA:不同產(chǎn)地的墨旱蓮(a采自湖南長沙，b采自湖北襄樊，d采自廣西桂林)；B：不同采收時(shí)間的墨旱蓮(c于2016年8月采收，d于2016年9月采收，e于2016年10月采收，f于2016年11月采收)

圖4 不同產(chǎn)地和不同采收時(shí)間的墨旱蓮代謝物的主成分分析載荷圖Figure 4 Loading plot of metabolites of Ecliptae Herba analyzed by principal components analysis based on different origins and different harvest timeA:不同產(chǎn)地的墨旱蓮；B：不同采收時(shí)間的墨旱蓮

圖5 不同產(chǎn)地墨旱蓮差異代謝物的相對含量Figure 5 Relative contents of differential metabolites of Ecliptae Herba harvested from different origins

圖6 不同采收時(shí)間墨旱蓮差異代謝物的相對含量Figure 6 Relative contents of differential metabolites of Ecliptae Herba harvested at different time

3 討 論

植物代謝組學(xué)是代謝組學(xué)研究的重要組成部分。GC-MS法是植物代謝組學(xué)研究中常用的分析技術(shù)，前處理是其中的關(guān)鍵步驟，是獲得可靠數(shù)據(jù)的前提。甲醇-氯仿-水體系是常用的提取液。作者前期考察了不同溶劑比例的提取液提取到的代謝物的數(shù)量和相對峰強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)甲醇-氯仿-水的體積比為3∶1∶1時(shí)，提取到的代謝物數(shù)量最多，峰強(qiáng)度合理，因此，選擇該比例的提取液作為提取溶劑。代謝組學(xué)常用的衍生化試劑包括雙(三甲基硅烷)-三氟乙酰胺(BSTFA)和MSTFA，兩者效果相似，但MSTFA沸點(diǎn)較低，對代謝物分析影響小，因此選擇MSTFA作為硅烷化試劑。

本研究基于GC-MS法對不同產(chǎn)地和不同采收時(shí)間的墨旱蓮藥材的代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，分別探討產(chǎn)地和采收時(shí)間對代謝物的影響，發(fā)現(xiàn)區(qū)分產(chǎn)地和采收時(shí)間的差異代謝物不盡相同。對比Fiehn[7]對擬南芥代謝組學(xué)的研究，在擬南芥分類中起著重要作用的物質(zhì)，如蘋果酸、葡萄糖、果糖等在本研究中也顯示為主要的差異代謝物，而這些代謝產(chǎn)物是否可直接用于墨旱蓮產(chǎn)地或采收時(shí)間的區(qū)分有待進(jìn)一步研究。

墨旱蓮喜生于濕潤之地，耐陰性強(qiáng)，能在陰濕地上生長良好，不耐干旱，在稍干旱之地，植株矮小，生長不良，因此生長地的氣候環(huán)境對植株的生長很重要。湖南和湖北四季分明，全年雨量充沛，但在7～8月常有伏旱，而廣西桂林地處低緯，屬中亞熱帶季風(fēng)氣候，氣候溫和，雨量充沛，光照充足，夏長冬短，雨熱基本同季。產(chǎn)地為廣西桂林的墨旱蓮代謝物在第一主成分上與產(chǎn)自湖北襄樊和湖南長沙的分離趨勢更為明顯，因此，氣候條件可能是造成墨旱蓮代謝產(chǎn)物存在差異的原因之一[8]。肌醇是植物生長和發(fā)育的必要條件，在植物體內(nèi)作為重要的前體和原料，參與細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的生成、營養(yǎng)儲(chǔ)存、信號(hào)傳導(dǎo)、逆境調(diào)節(jié)等多種生命活動(dòng)，發(fā)揮著重要的生理作用[9]。脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組分之一，并以游離狀態(tài)廣泛存在于植物體中。植物在受到不同環(huán)境脅迫時(shí)，其體內(nèi)常伴有游離脯氨酸的積累，這可能與逆境水平及植物對這種逆境的抗性有關(guān)[10]。本研究中肌醇和脯氨酸被篩選為不同產(chǎn)地的墨旱蓮的差異代謝物，可能與植物的抗逆脅迫有關(guān)。

中藥的化學(xué)成分是藥材植株在生長發(fā)育過程中的代謝產(chǎn)物，在不同生長發(fā)育階段，代謝產(chǎn)物的累積不同，因此不同采收時(shí)間對藥材代謝產(chǎn)物的數(shù)量和含量具有較大影響。與9月份和10月份采收的樣品相比，8月份采集的墨旱蓮樣品大部分代謝產(chǎn)物含量偏低，11月份采集的樣品含量較高。墨旱蓮的花期為7～9月，果期為9～10月，一般在果實(shí)近成熟時(shí)采收。本研究中8月份采集的樣品為幼果期，可能是該組藥材大部分代謝產(chǎn)物含量偏低的主要原因。初級(jí)代謝是次級(jí)代謝的基礎(chǔ)，可以為次級(jí)代謝產(chǎn)物合成提供前體物和所需要的能量；次級(jí)代謝則是初級(jí)代謝在特定條件下的繼續(xù)與發(fā)展，這些差異的初級(jí)代謝產(chǎn)物對于藥材的次級(jí)代謝產(chǎn)物含量的影響，有待進(jìn)一步研究。