宋 楊，劉紅弟，王海波，張紅軍，劉鳳之

(中國農業(yè)科學院 果樹研究所，農業(yè)部園藝作物種質資源利用重點實驗室，遼寧省落葉果樹礦質營養(yǎng)與肥料高效利用重點實驗室，遼寧 興城 125100)

越橘亦稱藍莓，是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp.)植物，為多年生常綠或落葉灌木樹種。越橘作為我國一種新興的果樹作物之一，栽植面積和產量穩(wěn)步增長[1-2]。低溫是影響植株生長發(fā)育、品質和產量形成的主要環(huán)境因子之一[3-8]，早春低溫和晚春霜凍對越橘直接造成傷害或間接影響開花和坐果[9-10]。因此，探討越橘抗寒機制，提高抗低溫能力，對越橘抗寒育種具有重要意義。

不同果樹品種抗低溫能力差異較大，抗寒能力遺傳改良是減輕低溫傷害的有效途徑之一。越橘不同品種抗低溫能力差異較大，其對低溫耐受能力主要取決于低溫馴化程度[11]。在植物低溫馴化過程中，細胞組織結構和基因表達水平均會發(fā)生變化[12]。ICE1-CBF-COR低溫應答通路是植物響應低溫脅迫的主要信號傳導模塊之一[13-14]。ICE1(Inducer of CBF3 expression 1)為bHLH(Basic helix-loop-helix)轉錄因子家族成員之一。在擬南芥中，AtICE1結合AtCBF3(CRT binding factor 3)啟動子MYC結合位點(CANNTG)，激活AtCBF3的表達，AtCBF3促進AtCOR(Cold-regulated)的轉錄，使擬南芥響應低溫脅迫[15]。ICE1基因突變可抑制CBF3的表達，并削弱植株對低溫的抗性；超表達ICE1可顯著提高轉基因植株低溫抗性[16-17]。

作為多年生木本植物越橘，低溫對樹體生長具有重要影響。目前關于ICE1基因調控植物低溫抗性已有大量研究，但主要集中在水稻[18]、葡萄[19]和小麥[20]等物種中，越橘中ICE1同源基因的研究尚無報道。本研究以抗寒性較強的越橘品種北陸為試材，分離并鑒定1個越橘ICE1基因VcICE1，通過表達模式、轉基因分析及瞬時表達試驗，探討VcICE1在調節(jié)越橘響應低溫信號過程中的作用，為越橘抗寒育種提供背景資料。

1 材料和方法

試驗于2017年5月-2018年9月在中國農業(yè)科學院果樹研究所、農業(yè)部園藝作物種質資源利用重點實驗室和山東農業(yè)大學作物生物學國家重點實驗室進行。

1.1 試驗材料

試驗所用的植物材料為5年生越橘品種北陸(VacciniumcorymbosumNorthland)及其組培苗、野生型擬南芥(Arabidopsisthaliana)和本氏煙草(Nicotianabenthamiana)。

將長勢一致的越橘組培苗置于每天16 h光照，光強2 500～3 000 lx，溫度為4 ℃的光照培養(yǎng)箱中，分別在處理0，1，8，16，32 h后取葉片，液氮速凍后-70 ℃保存?zhèn)溆?。對照置于光照培養(yǎng)箱中25 ℃條件下。野生型擬南芥用來遺傳轉化。本氏煙草用來進行瞬時表達試驗。

1.2 基因克隆和序列分析

以擬南芥AtICE1和蘋果MdICE1基因為參考序列，在越橘轉錄組數(shù)據庫[21]中進行Blast檢索。以越橘葉片的cDNA為模板，根據檢索到的序列設計引物VcICE1-F/R擴增開放讀碼框序列(ORF)。PCR反應程序為：98 ℃預變性 3 min；98 ℃變性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳并回收目的條帶，連接到克隆載體pEAST blunt zero進行測序。所用的引物序列見表1。

利用軟件Weblogo 3(http：//weblogo.threeplusone.com)分析VcICE1蛋白的保守序列。利用軟件Mega 6.0(http：//www. megasoftware.net)引入多個擬南芥bHLH蛋白，對VcICE1 蛋白進行聚類分析。

1.3 RNA的提取與實時熒光定量qRT-PCR分析

分別提取越橘植株的根、1年生枝條(頂部第一和二節(jié)間部分)、幼葉、花(盛花期)和成熟果實(花后60 d)的總RNA，總RNA提取采用TaKaRa公司植物總RNA提取試劑盒(Code No.9769)。以總RNA為模板，使用MBI公司反轉錄試劑盒(Code No.K1621)合成cDNA。首先用普通PCR進行序列驗證，目的基因經PCR擴增、回收后，進行測序?；蛐蛄写_定后，進行實時熒光定量qRT-PCR分析。內參基因為VcGAPDH。在擬南芥中，以AtUBQ10作為內參基因。儀器為Bio-Rad公司CFX Connect PCR system，試劑為ThermoFisher公司PowerUpTMSYBRGreen Master Mix(Code No.A25742)。反應體系：SYBR Mixture 10.0 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，加去離子水至20 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，58 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)；每次循環(huán)第2步進行熒光采集。最后采用2-ΔΔCT法分析定量數(shù)據。所有PCR都設3次重復。實時熒光定量qRT-PCR引物見表1。

1.4 擬南芥轉化和鑒定

構建VcICE1-pRI101過量表達載體，并將其轉化農桿菌GV3101，利用農桿菌侵染花序法轉化野生型擬南芥。在含有卡那霉素的MS固體培養(yǎng)基上篩選轉基因植株。將抗性苗移栽至基質中并放入光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。純合轉基因株系用于試驗。具體參照Clough和Bent等[22]方法。載體構建時使用的引物見表1。

表1 所使用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.5 煙草葉片進行瞬時表達試驗

把含有ICE1蛋白結合位點，長度為1 128 bp的AtCBF3啟動子序列連接到pCAMBIA1301-GUS載體(AtCBF3pro-GUS)，轉化農桿菌GV3101，與VcICE1-pRI101共注射煙草葉片。注射3 d后的煙草葉片用于GUS活性分析。稱取1 g葉片，使用GUS提取緩沖液(50 mmol/L NaH2PO4pH值7.0，10 mmol/L EDTA，0.1% Triton X-100，0.1% 十二烷基氨酸鈉)提取葉片蛋白。使用康為世紀公司的BCA蛋白定量試劑盒(Code No. CW0014)對GUS蛋白進行定量。具體參照Yin等[23]和Jefferson等[24]方法。

將VcICE1的ORF序列重組到pGreenⅡ62-SK載體(VcICE1-pGreenⅡ62-SK)，將AtCBF3的啟動子序列重組到pGreenⅡ0800-LUC載體(AtCBF3pro-LUC)，轉化農桿菌GV3101，注射煙草葉片。具體參照An等[25]試驗方法。使用活體成像系統(tǒng)檢查熒光強度。

1.6 統(tǒng)計分析

使用SPSS軟件進行差異顯著性分析。不同字母代表差異顯著(P﹤0.05)。每個試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 越橘VcICE1的克隆、蛋白質結構域和系統(tǒng)進化分析

通過RT-PCR技術獲得長度約為1 600 bp的條帶。對所得片段測序分析，結果顯示，VcICE1的ORF長度為1 566 bp，編碼含有522個氨基酸的蛋白質。使用Weblogo 3分析VcICE1及其他植物ICE1蛋白的保守結構域。結果表明，VcICE1含有1個保守的bHLH結構域，屬于bHLH轉錄因子家族(圖1)。將VcICE1與擬南芥bHLH蛋白進行系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)VcICE1與AtICE1(AtbHLH116)的同源性最高(圖2)。因此命名為VcICE1，GenBank登錄號為MH717245。

圖1 越橘VcICE1蛋白與其他植物ICE1蛋白的bHLH保守結構域序列標簽Fig.1 The conserved domain logo of the VcICE1 in blueberry and other plant ICE1 protein

2.2 VcICE1和VcCBF3基因表達的分析

利用實時熒光定量qRT-PCR分析VcICE1和VcCBF3(GenBank登錄號為FJ222601)在越橘不同組織器官中的表達情況。結果顯示，VcICE1在幼葉中表達量最高，在果實中表達量最低。VcCBF3主要在幼葉中表達，其次在花中，在根、枝條和果實中表達均較低(圖3)。分析VcICE1和VcCBF3對低溫的響應。結果表明，在低溫處理后1，8，16，32 h，與低溫處理0 h比較，VcICE1的表達量分別提高3.00，4.30，6.52，10.26倍，VcCBF3的表達量分別提高1.63，4.78，5.54，8.65倍。隨低溫處理時間的增加，這2個基因的表達量均表現(xiàn)持續(xù)上調，在處理后32 h達到最高(圖4)。

2.3 異位表達VcICE1提高轉基因擬南芥低溫抗性

為進一步研究VcICE1的功能，構建該基因的植物超量表達載體。將重組表達載體轉化農桿菌GV3101，通過農桿菌介導的遺傳轉化侵染野生型擬南芥。實時熒光定量qRT-PCR檢測轉基因株系中VcICE1和AtCBF3的表達量，結果獲得OE-1和OE-2 2個轉基因株系，轉基因株系中VcICE1和AtCBF3的表達量均顯著高于野生型(圖5-A)。正常溫度(22 ℃)條件下，野生型與轉基因植株的根長無明顯差異。低溫(4 ℃)處理后，2個轉基因擬南芥株系的根長分別為2.96，3.21 cm，野生型為1.81 cm，2個轉基因株系的根長分別為野生型的1.63，1.77倍。轉基因植株的根長顯著高于野生型，說明超表達VcICE1可能提高了轉基因植株的低溫抗性(圖5-B-C)。

圖2 越橘VcICE1和擬南芥bHLH蛋白系統(tǒng)進化分析Fig.2 Phylogenetic relationships of VcICE1 of blueberry and bHLH protein of Arabidopsis thaliana

不同小寫字母表示差異顯著(P﹤0.05)。圖4-7同。Different lowercase letter indicate significant differences(P﹤0.05). The same as Fig.4-7.

2.4 VcICE1促進AtCBF3的表達

為研究VcICE1對冷信號途徑中其下游基因CBF3的調控作用，構建VcICE1-pGreenⅡ62-SK和AtCBF3pro-LUC載體，以及VcICE1-pRI101和AtCBF3pro-GUS載體，并在煙草葉片中瞬時表達。如圖6所示，共轉VcICE1和AtCBF3啟動子的葉片中，其相對熒光強度顯著高于對照，是對照的3.23倍。共轉葉片中相對GUS活性也顯著高于對照，為3.88倍(圖7)。說明VcICE1可促進AtCBF3的表達。

圖4 VcICE1和VcCBF3對低溫的響應Fig.4 Expression of VcICE1 and VcCBF3 genes in response to cold

3 結論與討論

低溫是嚴重影響植物生長發(fā)育、果實品質和產量的要素之一。探討植物抗低溫能力，是多年來農業(yè)領域的重點和熱點問題。闡明植物抗低溫脅迫的作用機制，具有重要的理論和實踐意義。

A.定量PCR分析VcICE1、AtCBF3在轉基因擬南芥VcICE1-OE-1和VcICE1-OE-2中的表達水平；B.低溫處理下野生型和轉基因VcICE1擬南芥幼苗的根長；C.野生型和轉基因VcICE1擬南芥幼苗耐低溫能力分析。A.qRT-PCR analysis of the expression level of VcICE1, AtCBF3 in VcICE1-OE-1 and VcICE1-OE-2 transgenic Arabidopsis; B.Relative root length of WT，VcICE1-OE-1 and VcICE1-OE-2 transgenic Arabidopsis; C.Phenotypes of WT，VcICE1-OE-1 and VcICE1-OE-2 transgenic Arabidopsis seedlings on chilling tolerance.

A.煙草葉片瞬時表達試驗;B.相對熒光強度。Ⅰ.VcICE1-pGreenⅡ62-SK和AtCBF3pro-LUC共同注射；Ⅱ. pGreenⅡ62-SK空載體和AtCBF3pro-LUC共同注射。A.Transient expression assay in tobacco leaf;B.Quantitative analysis of relative luminescence.Ⅰ. Co-injection of VcICE1-pGreenⅡ62-SK and AtCBF3pro-LUC;Ⅱ. Co-injection of pGreenⅡ62-SK and AtCBF3pro-LUC.

A.相對GUS活性。B.煙草瞬時表達試驗：Ⅰ.pRI101空載體和AtCBF3pro-GUS共同注射；Ⅱ.VcICE1-pRI101和AtCBF3pro-GUS共同注射。A.Quantitative analysis of relative GUS activity; B.Transient expression assay in tobacco leaf：Ⅰ.Co-injection of pRI101 and AtCBF3pro-GUS;Ⅱ.Co-injection of VcICE1-pRI101 and AtCBF3pro-GUS.

目前，在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)162個bHLH蛋白，其功能涉及抗逆、光信號傳導、激素信號傳導、生長發(fā)育和次生代謝物質合成等多個方面，其作用方式主要通過促進或抑制啟動子活性調控靶基因表達[26-35]。本研究從越橘中分離1個VcICE1基因，該基因編碼含有bHLH結構域的轉錄因子。VcICE1可與AtICE1(AtbHLH116)聚為一類，VcICE1與其他植物ICE1蛋白的保守功能域高度相似。因此，VcICE1可能是ICE1在越橘中的同源基因。

組織特異性表達分析顯示，擬南芥AtICE1在葉片和莖中表達量較高[15]。油菜BnICE1主要在下胚軸中表達[36]。蘋果MdICE1在葉片、休眠芽和花器官中大量表達，在春梢和愈傷組織中表達較弱[37]。在本研究中，VcICE1在幼葉中高表達，在根、枝條和果實中表達相對較低。這種時空表達的差異可能與不同物種特性有關。VcICE1與AtICE1及MdICE1均在葉片中高表達，暗示VcICE1可能與這2個物種的ICE1具有相似的調控植株響應低溫的生物學功能。

Feng等[37]研究表明，蘋果MdICE1結合CBF啟動子MYC結合位點，在擬南芥、煙草和蘋果中超表達MdICE1可顯著提高轉基因植株的低溫抗性[37]。擬南芥AtICE1響應低溫誘導表達，可促進其靶基因AtCBF3的轉錄提高植株低溫抗性，沉默AtICE1可抑制AtCBF3的表達，降低植株的低溫抗性[38]。本研究發(fā)現(xiàn)，越橘VcICE1和VcCBF3均可響應低溫信號上調表達，通過轉基因試驗證明超表達VcICE1可提高擬南芥的低溫抗性。瞬時表達試驗表明，VcICE1可激活AtCBF3啟動子活性。因此，越橘VcICE1與MdICE1及AtICE1的功能和作用方式相似，均是通過CBF途徑調控植株對低溫信號的響應。

綜上所述，本研究克隆獲得越橘低溫響應因子VcICE1，該基因可響應低溫信號而上調表達。VcICE1轉基因擬南芥表現(xiàn)提高植株低溫抗性的表型。瞬時表達試驗發(fā)現(xiàn)，VcICE1可促進AtCBF3的表達。該研究結果為深入探討ICE1基因調節(jié)越橘抗低溫脅迫機制提供了參考。