陳敏 ，康安鋒 ，王騏榕 ，王丹 ，楊峰 ,

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建福州 350122；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，上海 200433；3.上海長征醫(yī)院，上海 200433

光動力療法(PDT)中，單線態(tài)氧的生成能力是評價光動力活性的重要因素之一。二氫卟吩(Ce6)是具有較高1O2量子產(chǎn)率的光敏劑，介孔二氧化硅納米粒是具有較大的孔表面積和良好的生物相容性的納米載藥體系[1]；該課題制備了一種雙孔道有序介孔二氧化硅納米粒，通過化學(xué)交聯(lián)法在孔道表面負(fù)載Ce6，利用紫外吸收光譜法來判斷載藥情況。通過近紅外發(fā)光法測定1O2的生成和產(chǎn)率，同時研究該系統(tǒng)對黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)的殺傷作用和誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的能力，以期得到新型納米載藥體系。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)和三甲基十六烷基溴化銨(TEOs)及正己烷均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，二氫卟吩(Ce6,百靈威科技有限公司)，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTS)購自美國阿拉丁工業(yè)公司，小鼠黑色素瘤細(xì)胞（B16，海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院提供），活性氧、CCK8試劑盒，透射電鏡，電位測定儀，紫外分光光度計(jì)，近紅光電倍增管，多功能酶標(biāo)儀等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 介孔硅(MSN)的制備 參考文獻(xiàn)[2]采用改進(jìn)Stober方法合成雙孔道介孔硅納米粒，稱取0.48 gCTAB溶于240 mL去離子水，滴加2 mLTEOs和10 mL正己烷混合溶液,繼續(xù)反應(yīng)12 h,離心洗滌。分散于100 mL無水乙醇和2 mL 5M的HCl混合液，離心洗滌得MSN。在N2保護(hù)下滴加50 μL APTES，得介孔改性材料 MSN-NH2。

1.2.2 載Ce6介孔硅 (MSN/Ce6)的制備 稱取100 mgMSN加入150 mg N,N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC）和25 mgCe6得MSN/Ce6[3]。

1.2.3 介孔硅納米粒的表征 采用電位測定儀測定介孔硅的粒徑，通過透射電鏡 （TEM）觀察納米粒的形貌特征，QuadraSord SI吸附儀測得N2吸附-脫附等溫線；計(jì)算比表面積分布、孔徑和孔容[4]。

1.2.4 紫外吸收光譜測定 樣品溶于DMF溶劑，每個樣品4種濃度梯度，見表1，記錄不同樣品的掃描曲線。

表1 紫外吸收光譜測定中不同樣品的濃度

1.2.5 單線態(tài)氧產(chǎn)率的近紅外發(fā)光測定 檢測1O2的近紅外發(fā)光信號，定量評估1O2產(chǎn)率[5]。將樣品（表2）分別放入比色皿，依次采集5個濾光片的光譜信號，進(jìn)而鑒別出單線態(tài)氧發(fā)光信號。比較待測樣品與參考標(biāo)樣的1O2（max=1 270 nm）發(fā)光強(qiáng)度，計(jì)算待測樣品的1O2量子產(chǎn)率。

表2 單線態(tài)氧產(chǎn)率測定中不同樣品的濃度

1.2.6 CCK8法測細(xì)胞毒性 取對數(shù)生長期B16細(xì)胞孵育后加入不同濃度梯度（0.375、0.75、1.5、3、6、12 μg/mL）游離的Ce6、含等量Ce6的MSN/Ce6和空白載體材料MSN，并設(shè)空白對照組，每組設(shè)3個復(fù)孔避光培養(yǎng)。660 nm波長激光照射，光劑量為10 J/cm2，避光培養(yǎng)后每孔加入100 μL含10%CCK8的培養(yǎng)液，2 h后酶標(biāo)儀測定450 nm處OD值。

1.2.7 細(xì)胞內(nèi)單線態(tài)氧產(chǎn)生的檢測 取對數(shù)生長期B16細(xì)胞孵育后加入倍比稀釋的游離 Ce6 （0.375～12 μg/mL）、含等量Ce6的MSN/Ce6和載體材料MSN，并設(shè)空白對照，每組設(shè)3個復(fù)孔避光培養(yǎng)。每孔加入100 μL含DCFH-DA活性氧檢測試劑的無血清培養(yǎng)基，激光照射后測定各孔的吸光度值[6]。

2 結(jié)果

2.1 雙孔道介孔硅納米粒表征

納米粒的表征結(jié)果TEM圖（圖1）。電位測定儀測定其水合粒徑為159.2 nm，zeta電位值為-15.1 mV，材料比表面積為1 356 m2/g，總孔容積為2.40 cm3/g，孔徑約為5.62 nm。

圖1 MSN納米粒的結(jié)構(gòu)表征

2.2 吸收光譜檢測

通過不同樣品的紫外吸收光譜 （圖2），發(fā)現(xiàn)Ce6、MSN/Ce6在671 nm處有特征吸收峰,表明Ce6成功修飾到MSN-NH2外表面和孔道內(nèi)表面。

2.3 單線態(tài)氧近紅外發(fā)光檢測

近紅外光譜分辨圖（圖3A）顯示Ce6和MSN/Ce6在1 270 nm處有發(fā)光強(qiáng)度，其中Ce6的發(fā)光強(qiáng)度最強(qiáng)。不同樣品在1 270 nm處的近紅外時間分辨圖（圖3B）也驗(yàn)證了這點(diǎn)。單線態(tài)氧的產(chǎn)率呈現(xiàn)濃度依賴性(圖3C)。

圖2 載藥和不載藥MSN納米粒的紫外吸收圖譜

圖3 載藥和不載藥MSN納米粒的近紅外光譜分辨圖

2.4 細(xì)胞毒性檢測

圖示（圖4A）表明MSN不具有細(xì)胞毒性。經(jīng)光照射處理后（圖4B），游離Ce6組和MSN/Ce6均顯示較強(qiáng)的光毒作用，呈濃度依賴性。當(dāng)Ce6濃度達(dá)到3μg/mL時，兩組均可有效殺傷B16細(xì)胞，表明MSN/Ce具有體外光動力抗腫瘤活性。

圖4 MSN/Ce6對黑色素瘤B16細(xì)胞的暗毒性(A)和光毒性(B)

3 討論

該課題成功制備了雙孔道介孔硅納米粒，其獨(dú)特的介孔特性可以高效負(fù)載藥物。由于Ce6共價交聯(lián)負(fù)載在MSN孔道表面影響直接釋放，無法計(jì)算其載藥量的情況，于是利用紫外吸收光譜法來判定MSN是否成功負(fù)載Ce6。MSN與Ce6共價交聯(lián)后是否仍具有光學(xué)活性，具備產(chǎn)生1O2的能力，是值得探討的問題。利用近紅外發(fā)光法來測定樣品是否產(chǎn)生1O2以及1O2的產(chǎn)率，并選用B16細(xì)胞考察MSN/Ce6的細(xì)胞毒性和活性氧的產(chǎn)生。在載藥納米體系中檢測出1O2的產(chǎn)生，初步說明了MSN/Ce6具有較好的光動力療效，MSN/Ce6作用B16細(xì)胞后表現(xiàn)出顯著的細(xì)胞毒性和較高ROS的產(chǎn)生，表明載藥介孔硅納米粒具有一定的體外光動力作用。今后，可進(jìn)一步研究MSN/Ce6的抗腫瘤活性機(jī)制等方面。