梁叢穎，周 偏，張 琳，蔡 坤，劉四新,2，李從發(fā),*

（1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228；2.海南大學(xué)理學(xué)院，海南 海口 570228）

諾麗（Morinda citrifolia Linn.），又稱海巴戟天，系茜草科巴戟天屬植物，原產(chǎn)于太平洋島嶼、澳大利亞、東南亞以及我國的海南島、西沙群島等地[1]。早在2 000多年前，波利尼西亞土著居民就將諾麗作為民間藥物用于治療各種疾病，認(rèn)為其對糖尿病、高血壓、心臟病以及關(guān)節(jié)炎等疾病都有較好的預(yù)防和治療作用[2-4]。研究表明，諾麗果中不僅含有多糖、維生素、有機(jī)酸、多種氨基酸、生物堿等[5-6]營養(yǎng)和功效成分，還含有豐富的礦物質(zhì)，其含量占干物質(zhì)10%～12%，主要包括鎂、硫、鈣和磷等[7]。近年來，隨著人們生活水平的提高，諾麗的保健功能及藥用價值逐漸得到人們的認(rèn)可，受到研究者的青睞。諾麗發(fā)酵汁（諾麗酵素）作為市場上主要的產(chǎn)品形式，是一類新興的功能性微生物發(fā)酵產(chǎn)品，其加工工藝主要是以傳統(tǒng)自然發(fā)酵為主[8]。在整個發(fā)酵過程中，微生物（酵母菌、乳酸菌和醋酸菌等）通過吸收營養(yǎng)物質(zhì)維持生命和增殖，并降解基質(zhì)，使其發(fā)生一系列復(fù)雜的生物化學(xué)變化，導(dǎo)致發(fā)酵液成分發(fā)生改變，在一定程度上促進(jìn)了風(fēng)味和功能性化合物的合成[9]。

醋酸菌是一類重要的工業(yè)微生物，通常存在于自然發(fā)酵食品及飲料中，如傳統(tǒng)發(fā)酵食品食醋、果醋、紅茶菌、蘭比可啤酒、開菲爾和可可豆等[10-14]，同時醋酸菌在VC制造工業(yè)中也發(fā)揮著重要作用。近幾年針對諾麗發(fā)酵汁的研究大多集中在其生物活性分析及活性物質(zhì)解析方面[15-16]，對于諾麗自然發(fā)酵過程中發(fā)酵汁中微生物群落的分析及優(yōu)勢微生物的分離鑒定相對滯后。Wall等[17]對夏威夷諾麗自然發(fā)酵過程中微生物變化研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵至42 d時細(xì)菌數(shù)量達(dá)到峰值，且從發(fā)酵汁中分離出弗拉托葡糖桿菌（Gluconobacter frateurii）。施瑋筑[18]對諾麗自然發(fā)酵過程中菌群結(jié)構(gòu)及變化情況分析發(fā)現(xiàn)，醋酸菌為諾麗自然發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌（僅就細(xì)菌而言），對發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)地、口感、風(fēng)味和顏色都有重要的影響。因此清楚醋酸菌的種類及發(fā)酵特性有助于合理控制發(fā)酵進(jìn)程，更可以有效提高諾麗發(fā)酵汁的風(fēng)味品質(zhì)。16S rRNA在原核生物中廣泛存在，功能穩(wěn)定，其所攜帶的遺傳信息可以有效的反應(yīng)生物界的進(jìn)化關(guān)系，同時操作簡便，適用于各級分類單元，在系統(tǒng)分類學(xué)以及進(jìn)化研究中有著重要的應(yīng)用意義[19]。

本研究針對諾麗自然發(fā)酵汁中的醋酸菌進(jìn)行篩選、分離純化，并利用生理生化實驗進(jìn)行初步鑒定，16S rRNA同源序列分析，對比所獲得的醋酸菌與工業(yè)菌株AS1.41的發(fā)酵特性，為醋酸菌的篩選提供較好的參考，以期得到性能優(yōu)良的醋酸菌菌株，在豐富優(yōu)質(zhì)醋酸菌庫的同時，為諾麗發(fā)酵汁品質(zhì)的提高以及諾麗新產(chǎn)品開發(fā)等提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料與試劑

諾麗果于2016年11月采摘自海南省萬寧市；醋酸菌AS1.41（惡臭醋酸桿菌）來自廣東微生物菌種保藏中心。

十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tris-HCl、乙二胺四乙酸（ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA） 上海生物工程科技服務(wù)有限公司；苯酚、氯仿、異戊醇、瓊脂糖 北京索萊寶科技有限公司；6×DNA loading buffer（含二甲苯菁和溴酚藍(lán)雙染料）、2×Es Taq Master Mix、D2000 DNA ladder、蛋白酶K北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；Goldview DNA染料美國Amerco公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：1.0%葡萄糖，1.0%酵母膏，pH值自然，121 ℃滅菌20 min，使用前加入3.0%（體積分?jǐn)?shù)，下同）無水乙醇。

產(chǎn)酸定性培養(yǎng)基：同基礎(chǔ)培養(yǎng)基，121 ℃滅菌20 min，冷卻后加入5.0%乙醇。

分離和斜面保藏培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入2.0%瓊脂，滅菌后加2.0%無菌CaCO3和3.0%乙醇，制成平板，即為分離培養(yǎng)基；基礎(chǔ)培養(yǎng)基加入2.0%瓊脂，分裝于試管，滅菌后加入3.0%乙醇，擺成斜面，即為斜面保藏培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：2%葡萄糖，1.0%酵母膏，0.5%蛋白胨，自然pH值，121 ℃滅菌20 min，使用前加入3.0%乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；T6新世紀(jì)紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠；Biofuge primo R高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技有限公司；A300聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀杭州郎基科學(xué)儀器有限公司；FA-1604電子天平 上海良平儀器儀表有限公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱 韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋常州國華電器有限公司；ZHWY-211B恒溫培養(yǎng)振蕩器上海智城分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 諾麗自然發(fā)酵

選取新鮮成熟、無腐爛變質(zhì)、無病蟲害的諾麗果，清洗其表面，經(jīng)無菌水洗滌并瀝干后置于無菌容器內(nèi)。置于陰暗處，室溫（22～28 ℃）自然發(fā)酵2 個月。每隔6 d在無菌環(huán)境中取樣備用。

1.3.2 菌株的富集培養(yǎng)

取諾麗自然發(fā)酵汁5 mL，裝入含有100 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃、160 r/min培養(yǎng)2～3 d，即可得到初篩菌株富集培養(yǎng)液。

1.3.3 菌株的分離純化

選取合適稀釋度的富集培養(yǎng)液涂布于分離培養(yǎng)基平板上，于30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)2～3 d后觀察，每個梯度3個重復(fù)。根據(jù)菌落形態(tài)特征及碳酸鈣溶菌圈的大小挑取長勢良好的單菌落。采用劃線法進(jìn)行分離純化，通過革蘭氏染色鏡檢初步確認(rèn)是否為疑似醋酸菌菌株，接種于斜面保藏培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)2 d后于4 ℃的冰箱中保藏。

1.3.4 醋酸菌的定性實驗

取培養(yǎng)2 d的醋酸產(chǎn)生菌及參照菌AS1.41進(jìn)行生理生化實驗，具體鑒定方法和依據(jù)參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[20]。

1.3.5 醋酸菌的16S rRNA鑒定

醋酸菌基因組DNA的提取按照參考CTAB法[21-23]。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳后，置于紫外燈下觀察，若出現(xiàn)清晰的條帶，并且無明顯非特異性擴(kuò)增，即判斷PCR成功。由上海英濰捷基有限公司完成測序工作。利用NCBI數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行BLAST同源性對比分析，選擇與目的基因序列同源性最高的序列，選取不同的模式菌株，采用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.6 醋酸菌發(fā)酵性能的測定

1.3.6.1 菌株生長曲線測定

將菌株挑取1 環(huán)接種于50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)，每隔6 h測定菌株的生長量。

1.3.6.2 菌株耐受性的測定

耐高溫性能測定：將篩選鑒定出的所有醋酸菌活化后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在28、31、34、37、40 ℃的條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h，轉(zhuǎn)速160 r/min，每隔12 h測量菌株的生長量及產(chǎn)酸量，每株醋酸菌3 個重復(fù)。

耐乙醇性能測定：將篩選鑒定出的所有醋酸菌活化后接入發(fā)酵培養(yǎng)基中（乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為1%、3%、5%、7%、9%），在30 ℃、160 r/min的條件下?lián)u床培養(yǎng)72 h，每隔12 h測定生長量和產(chǎn)酸量，每株醋酸菌3 個重復(fù)。

1.3.7 菌株生物量及產(chǎn)酸量的測定

生物量測定以O(shè)D600nm值表示；產(chǎn)酸量測定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》[24]，以乙酸計算總酸量。

2 結(jié)果與分析

2.1 醋酸菌的分離純化

以諾麗自然發(fā)酵汁為樣本，按照1.3.1、1.3.2節(jié)方法進(jìn)行菌株富集培養(yǎng)和分離純化，共得到67 株供試菌株。通過革蘭氏染色鏡檢結(jié)果排除21 株革蘭氏陽性菌株，見圖1。從剩下的46 株菌種中挑選24 株進(jìn)行生理生化試驗，結(jié)果表明該24 株菌種均為過氧化氫酶陽性，且醋酸菌定性實驗均有紅褐色沉淀，為醋酸菌疑似菌株。

圖1 菌株革蘭氏染色鏡檢圖Fig. 1 Microscopic pictures of Gram-stained bacterial strains

2.2 16S rRNA的鑒定

2.2.1 菌株DNA的提取及PCR擴(kuò)增結(jié)果

將初步篩選出的醋酸菌進(jìn)行DNA提取及PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增后的部分電泳結(jié)果如圖2所示。

圖2 菌株16S rRNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of 16S rRNA PCR amplification products from suspicious strains of acetic acid bacteria

由圖2可知，所有醋酸菌疑似菌株16S rRNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的片段大小均在1 500 bp左右，且擴(kuò)增條帶非常清晰明亮可見，無明顯非特異性擴(kuò)增，故該PCR產(chǎn)物可滿足后續(xù)實驗要求。

2.2.2 16S rRNA 序列同源分析鑒定利用NCBI數(shù)據(jù)庫，將篩選和鑒定的菌株的16S rDNA序列進(jìn)行BLAST分析，選擇準(zhǔn)確率在98%及以上的分析結(jié)果作為鑒定結(jié)果。本實驗根據(jù)鑒定菌株的16S rRNA基因序列同源分析，成功鑒定出24 株醋酸菌，分別編號為N1～N24，如表1所示。從諾麗發(fā)酵汁中共鑒定出醋酸桿菌屬（Acetobacter）和葡糖桿菌屬（Gluconobacter）兩大類，包括可可豆醋酸桿菌A. fabarum（9 株）、蒲桃醋酸桿菌A. syzygii（7 株）、巴氏醋酸桿菌A. pasteurianus（2 株）、熱帶醋酸桿菌A. tropicalis（1 株）、蘭比可醋酸桿菌A. lambici（1 株）、日本葡糖桿菌G. japonicus（4 株）6 個種，可見諾麗發(fā)酵汁中醋酸菌的豐富多樣性。其中A. lambici及A. tropicalis主要存在于發(fā)酵初始階段，A. pasteurianus則在發(fā)酵2 周之后才出現(xiàn)，主要存在于發(fā)酵中期，而A. fabarum、A. syzygii、G. japonicus在整個自然發(fā)酵過程中均有發(fā)現(xiàn)，且A. fabarum和A. syzygii分別占菌株總數(shù)的37.5%和29.2%，表明A. syzygii和A. fabarum為諾麗自然發(fā)酵過程中的主要優(yōu)勢醋酸菌。

表1 16S rRNA序列同源分析鑒定Table 1 Identification of isolates based on 16S rRNA sequencing

曹艷花等[25]從諾麗原漿中分離得到A. fabarum CICC10883，發(fā)現(xiàn)其能利用葡萄糖和D-木糖發(fā)酵產(chǎn)酸。張欣等[26]從諾麗發(fā)酵果原漿中首次分離到1 株東方醋酸桿菌（A. orientalis）CICC10881。施瑋筑[18]從諾麗自然發(fā)酵汁中得到13 個醋酸菌分離物，但未進(jìn)行明確的種屬鑒定。因此，本研究篩選出的A. fabarum、A. lambici均為首次在諾麗自然發(fā)酵汁中分離獲得。

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

選取代表菌株及其相似菌種，采用MEGA7.0軟件進(jìn)行序列分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示各菌株的分類學(xué)地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，結(jié)果如圖3所示。

圖3 醋酸菌的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of acetobacter acid bacteria based on their 16S rDNA sequences

由圖3可知，代表菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹中基本分為6 個分支：N21與A. tropicalis A77和A. tropicalis Y-1BM處于同一分支；N11與G. japonicus NBRC3271和G. japonicus HD1025為一個分支；N4與A. pasteurianus NBRC3248處于同一分支；N17與A. fabarum G2-5為一個分支；N10與A. lambici LMG27439為一個分支；N5與A. syzygii NBRC16604和A. syzygii 9H-2為一個分支。上述結(jié)果已用Bootstrap檢驗1 000 次隨機(jī)重復(fù)驗證支持該分支。綜合代表菌株生理生化實驗和系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果，可確定其代表菌株中，N21為A. tropicalis，N11為G. japonicus，N4為A. pasteurianus，N17為A. fabarum，N10為A. lambici，N5為A. syzygii，與16S rRNA序列比對分析結(jié)果一致。

2.3 醋酸菌的發(fā)酵特性

2.3.1 菌株的生長曲線

圖4 醋酸菌生長曲線Fig. 4 Growth curves of acetic acid bacteria

由圖4可知，7 株醋酸菌的生長曲線相似，N4、N10和N11對數(shù)期為6～48 h，其他菌株的對數(shù)生長期均在6～66 h。其中，N10生長速率最快，在12 h時OD600nm值達(dá)到0.810，N21和參照菌株AS1.41生長速率次之且生長量最高，其次是N5、N17、N11和N4，說明菌株N10和N21相比于其他菌株更加適應(yīng)該條件。處于對數(shù)生長期的菌種活力最強(qiáng)，對外界環(huán)境因素較為敏感，代謝活躍，繁殖能力強(qiáng)，此階段接種可使菌體活性達(dá)到最高[27]，因此選取各菌株種子液培養(yǎng)時間為48 h。

2.3.2 菌株的耐高溫性能

不同種屬的醋酸菌具有不同的最適溫度。在一定的溫度范圍內(nèi)，溫度的上升有利于醋酸菌的生長及產(chǎn)酸代謝，但溫度過高會加快菌體老化，降低產(chǎn)酸速率，導(dǎo)致菌體內(nèi)酶結(jié)構(gòu)的破壞和酶活性的喪失，甚至直接死亡[28]。由圖5可知，7 株醋酸菌在28～40 ℃的溫度范圍內(nèi)均能生長，且生長量和產(chǎn)酸量隨著溫度的上升呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢。N11、N17分別在28、31 ℃時生長量和產(chǎn)酸量最高，而N4、N5和AS1.41的最適生長溫度為34 ℃。當(dāng)培養(yǎng)溫度在28～34 ℃范圍時，N4、N5、N10、N17、N21和AS1.41的生長量和產(chǎn)酸量變化較小，而菌株N11相對敏感。溫度為31 ℃時，菌株N21的產(chǎn)酸量在各菌株中最高，達(dá)到28.92 g/L；當(dāng)溫度升至40 ℃時，7 個菌株均能維持一定程度的生長，但只有N21和參照菌株AS1.41依然保持較好的產(chǎn)酸性能，產(chǎn)酸量分別為14.85 g/L和16.21 g/L。表明在高溫條件下N21依然具有較高的乙醇利用率。

圖5 溫度對7 株菌OD600 nm（A）和產(chǎn)酸量（B）的影響Fig. 5 Effect of temperature on OD600 nm (A) and acetic acid production (B) of seven strains

Soemphol等[29]對從泰國水果中分離出的A. tropicalis SKU1100研究發(fā)現(xiàn)，SKU1100具有高耐熱性，在40 ℃以上的高溫條件下仍可以較好生長。此外，將熱帶醋酸桿菌應(yīng)用于羅非魚養(yǎng)殖過程中，可以促進(jìn)羅非魚生長，提高羅非魚的消化酶和血清非特異性免疫活性，并對凈化水體水質(zhì)方面有積極作用[30]。因此推斷，將實驗篩選出的A. tropicalis應(yīng)用于諾麗及其他食品發(fā)酵中，可能會對其助消化、提高免疫力等功能特性有積極影響，為開發(fā)特定保健功能的新產(chǎn)品提供新的思路。

2.3.3 菌株的耐乙醇性能

醋酸菌主要依靠氧化乙醇形成醋酸，但高體積分?jǐn)?shù)乙醇會抑制醋酸菌生長，使得乙醇轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)酸速率下降，從而影響醋酸產(chǎn)量[31]。由圖6可知，隨著初始乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，各菌株生長量基本呈下降趨勢，產(chǎn)酸量均呈先增加后減小趨勢；各醋酸菌基本上在乙醇體積分?jǐn)?shù)為1%時生長量最大，乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%產(chǎn)酸量最高，表明低體積分?jǐn)?shù)乙醇會限制醋酸菌的產(chǎn)酸量。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)增加到7%時，菌株N4和N5基本停止生長，N11、N17、N21和AS1.41的生長有所抑制，但OD600nm值均能達(dá)到0.650以上，且只有N21和參照菌株AS1.41能維持較高的產(chǎn)酸效率，產(chǎn)酸量達(dá)到23.60 g/L，略高于參照菌株AS1.41（22.77 g/L）。

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)對7 株菌OD600 nm（A）和產(chǎn)酸量（B）的影響Fig. 6 Effect of ethanol concentration on OD600 nm (A) and acid production (B) of seven strains

對比國內(nèi)外其他研究，李大為等[32]從自然發(fā)酵蘋果醋中篩選鑒定出耐受性較高的A. tropicalis B104，產(chǎn)酸量達(dá)33.2 g/L，耐乙醇體積分?jǐn)?shù)為7%，與本實驗研究結(jié)果相一致。張志燕等[33]對鎮(zhèn)江香醋醋醅中的優(yōu)勢醋酸菌進(jìn)行了篩選和分離鑒定，得到8 株醋酸菌，其中醋酸菌D-3-4可耐受體積分?jǐn)?shù)9%乙醇以及42 ℃高溫，且產(chǎn)酸量達(dá)到60 g/L，為優(yōu)勢高產(chǎn)酸菌株。盧夢瑤等[34]從多種水果酵素中分離出1 株較高產(chǎn)醋酸菌株芝庇儂醋酸桿菌（A. cibinongensis）LMY-1，在乙醇體積分?jǐn)?shù)4%時其產(chǎn)酸最高達(dá)到22.72 g/L，本研究篩選出的菌種N21（A.tropicalis）其產(chǎn)酸量高于LMY-1。

3 結(jié) 論

本研究采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法從諾麗自然發(fā)酵汁中分離鑒定出67 株菌。綜合傳統(tǒng)形態(tài)培養(yǎng)特征、生理生化實驗和16S rRNA基因序列分析同源性分析，最終鑒定出24 株醋酸菌，分別為A. fabarum（9 株）、A. syzygii（7 株）、A. pasteurianus（2 株）、A. tropicalis（1 株）、A. lambici（1 株）和G. japonicus（4 株），可見諾麗發(fā)酵汁中醋酸菌的豐富多樣性，A. fabarum和A. syzygii分別占菌株總數(shù)的37.5%和29.2%，為諾麗發(fā)酵汁中的主要優(yōu)勢醋酸菌種。在菌株發(fā)酵特性對比研究中，不同醋酸菌株對溫度和乙醇的耐受性差異顯著，A. tropicalis N21在乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%時產(chǎn)酸量最高，達(dá)到28.92 g/L，在40 ℃高溫中仍能良好生長且產(chǎn)酸量為14.85 g/L，在體積分?jǐn)?shù)為7%時，產(chǎn)酸量依然達(dá)到23.60 g/L，具有良好的生長特性和發(fā)酵產(chǎn)酸能力，且耐溫及耐乙醇特性優(yōu)于其他5 株醋酸菌，可考慮作為優(yōu)勢醋酸菌株，用于諾麗純種發(fā)酵。

本實驗全面研究了諾麗自然發(fā)酵過程中醋酸菌的多樣性及分布，不僅豐富了諾麗中醋酸菌種屬信息，同時為諾麗發(fā)酵汁傳統(tǒng)工藝的改善及諾麗發(fā)酵產(chǎn)品的開發(fā)利用提供一定理論基礎(chǔ)。但由于在諾麗發(fā)酵汁中關(guān)于醋酸菌的研究尚少，其在諾麗發(fā)酵過程中的作用和功能以及在諾麗發(fā)酵汁中的功效性成分的產(chǎn)生方面是否發(fā)揮一定的作用，還有待于進(jìn)一步研究。