王 敬，田 蓓

(1．武漢華夏理工學院生物制藥工程系，湖北 武漢 430223；2.浙江工業(yè)大學生物工程學院，浙江 杭州 310014)

自1940年青霉素用于臨床治療各種感染性疾病，70多年來，它挽救了無數(shù)人的生命，為維護人類的健康立下汗馬功勞。但由于抗生素的不合理使用，導(dǎo)致許多細菌產(chǎn)生耐藥性。為應(yīng)對細菌耐藥性引發(fā)的不良后果，除了致力于篩選對耐藥菌有效且具有新抗菌譜、新作用機制的抗生素外，人們開始尋找能提高抗生素效能、拮抗細菌耐藥性的物質(zhì)。黃柏中的小檗堿抗菌譜廣，體外對多種細菌具有抑菌作用，關(guān)于小檗堿的抑菌機制，目前主要有以下幾方面的報道：①抑制拓撲異構(gòu)酶的活性[1]。拓撲異構(gòu)酶能夠催化DNA鏈的斷裂和結(jié)合，從而抑制細菌DNA的合成。目前針對拓撲異構(gòu)酶這一作用位點設(shè)計具有殺傷腫瘤細胞的藥物已成為研究的熱點。②拮抗細菌產(chǎn)生的腸毒素[2]。③降低細菌對細胞的粘附性[3]。④與細菌核糖體30S亞基結(jié)合影響蛋白質(zhì)的合成[4]。同時小檗堿還能增強白細胞及肝網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬能力。本論文主要研究黃柏70%乙醇粗提物與氨芐青霉素聯(lián)合使用時對大腸桿菌的體外抑菌效果，旨在為臨床合理利用中草藥、中西醫(yī)結(jié)合治療細菌感染提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌(由武漢華夏理工學院微生物實驗室提供)。

1.1.2 藥物

黃柏(購自武漢三九藥店)。

1.1.3 培養(yǎng)基

MHA培養(yǎng)基(購自青島海博生物公司)，用于測定藥物的MIC值；牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，用于制備大腸桿菌菌液；牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，用于活化大腸桿菌。

1.2 方法

1.2.1 黃柏70%乙醇粗提物的制備

量筒量取378 mL無水乙醇，加入42 mL蒸餾水，配制成70%的乙醇溶液420 mL。取黃柏藥材適量，粉碎，過20目篩，稱取藥粉20g，用70%乙醇水浴回流提取三次[5]，每次用溶劑140 mL，提取1 h，過濾，合并三次提取濾液，將濾液置離心機中，于3000 r/min離心2 min，取上清液加熱濃縮，回收乙醇，直至濃縮液體積為20 mL，相當于原黃柏的濃度為1000 mg/mL，將濃縮液裝入試管，塞好棉塞，放入高壓蒸汽滅菌鍋，121 ℃滅菌20 min后，4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2.2 大腸桿菌菌液制備

取新鮮培養(yǎng)的大腸桿菌斜面菌種一支，接入含牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的三角瓶中，置37 ℃搖床200 r/min恒溫培養(yǎng)18 h，加入無菌蒸餾水調(diào)整大腸桿菌菌液濃度，使其在600 nm處的吸光度為0.4左右，稀釋好的菌液備用。

1.2.3 黃柏70%乙醇粗提物的MIC值測定

取十支大試管，先各加入8 mL溶化的MHA培養(yǎng)基，然后吸取黃柏70%乙醇粗提物8 mL加入第一支試管，混合均勻后吸出8 mL液體放入第二支試管，依次類推，梯度稀釋，直到第八支試管。第八支試管吸出8 mL液體丟棄。八支試管所含溶液相當于原黃柏質(zhì)量濃度分別為500 g/L,250 g/L,125 g/L,62.5 g/L,31.3 g/L,15.7 g/L,7.8 g/L,3.9 g/L。第九支、第十支試管里只裝8 mLMHA培養(yǎng)基用于制作對照。十支試管滅菌后，分別倒入已干燥好的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)凝固使用。在培養(yǎng)皿底部標記接種的位置和藥液濃度，接種制備好的大腸桿菌稀釋液。其中第九個培養(yǎng)皿不接菌作為陰性對照，第十個培養(yǎng)皿接菌作為陽性對照。將所有平板倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。

1.2.4 氨芐青霉素的MIC值測定

用無菌生理鹽水將氨芐青霉素鈉粉針配制成質(zhì)量濃度為50 g/L的溶液，微孔濾膜過濾備用。準備十支已滅菌的裝有9 mLMHA培養(yǎng)基的試管，吸取1 mL 50 g/L的氨芐青霉素加入第一支試管，混合均勻后，從中吸取1 mL溶液加入第二支試管中，以此類推，梯度稀釋，直到第八支試管。第八支試管吸出1 mL液體丟棄。八支試管中氨芐青霉素的質(zhì)量濃度分別為5 g/L,5×10-1g/L,5×10-2g/L，5×10-3g/L，5×10-4g/L，5×10-5g/L,5×10-6g/L,5×10-7g/L。第九支、第十支試管里只裝9 mLMHA培養(yǎng)基用于制作對照。將十支試管內(nèi)含物分別倒入已干燥好的無菌培養(yǎng)皿內(nèi)凝固使用。在培養(yǎng)皿底部標記接種的位置和藥液濃度，接種制備好的大腸桿菌稀釋液。其中第九個培養(yǎng)皿不接菌作為陰性對照，第十個培養(yǎng)皿接菌作為陽性對照。將所有平板倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。

1.2.5 黃柏70%乙醇粗提物與氨芐青霉素聯(lián)用的FIC指數(shù)測定

取含有黃柏70%乙醇粗提物1/16MIC,1/8MIC,1/4MIC,1/2MIC,MIC，2MIC的MHA培養(yǎng)基，分別與含有氨芐青霉素10-4MIC,10-3MIC,10-2MIC,10-1MIC,MIC,10MIC的MHA培養(yǎng)基，兩兩等量混合，制成36個聯(lián)合含藥平板?；旌虾簏S柏70%乙醇粗提物相當于原黃柏的質(zhì)量濃度為31.3 g/L，15.7 g/L，7.8 g/L，3.9 g/L，1.95 g/L，0.975 g/L,氨芐青霉素終濃度為2.5×10-5g/L，2.5×10-6g/L，2.5×10-7g/L，2.5×10-8g/L，2.5×10-9g/L，2.5×10-10g/L。另制備兩份空白培養(yǎng)基作為陰、陽性對照。接種，待菌液完全吸收后，將38個培養(yǎng)皿倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h，以不能產(chǎn)生肉眼可見的菌落為標準，記錄兩種藥物聯(lián)合使用時的MIC,根據(jù)公式計算FIC。當FIC指數(shù)小于0.5時，兩種藥物聯(lián)用表現(xiàn)協(xié)同效應(yīng)；指數(shù)在0.5～1時，為累加效應(yīng)；指數(shù)大于1小于2時，為無關(guān)效應(yīng)，大于2時為拮抗效應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1 MIC值測定結(jié)果

取出平行的一組培養(yǎng)皿及陰陽性對照，觀察有無肉眼可見菌落。黃柏70%乙醇粗提物的MIC值測定結(jié)果見表1，質(zhì)量濃度為500 g/L,250 g/L,125 g/L,62.5 g/L,31.3 g/L,15.7 g/L的含藥平板上無菌落生長，表明黃柏70%乙醇粗提物的MIC值為15.7 g/L。氨芐青霉素的MIC值測定結(jié)果見表2，質(zhì)量濃度為5 g/L,5×10-1g/L,5×10-2g/L，5×10-3g/L，5×10-4g/L，5×10-5g/L的含藥平板上無菌落生長，表明氨芐青霉素的MIC值為5×10-5g/L。

表1 黃柏70%乙醇粗提物的MIC Table 1 The MIC of 70% ethanol crude extract of Cortex Phellodendri

表2 氨芐青霉素的MIC Table 2 The MIC of ampicillin

注："-"代表無菌落，"+"代表有菌落。Note:"-"means no colony,"+"means colony

2.2 FIC值測定結(jié)果

取出38個含藥培養(yǎng)皿，觀察有無肉眼可見菌落。由表3可知，兩藥聯(lián)用后，黃柏70%乙醇粗提物的MIC為7.8 g/L，為單藥用量的1/2；氨芐青霉素的MIC為2.5×10-8g/L，為單藥用量的1/2000。根據(jù)分級抑菌濃度計算公式，F(xiàn)IC指數(shù)=MIC(A組聯(lián)合)/MIC(A組單用)+ MIC(B組聯(lián)合)/MIC(B組單用)，得到FIC指數(shù)約為0.5005，在0.5～1之間，所以黃柏70%乙醇提取物和氨芐青霉素聯(lián)用表現(xiàn)為累加效應(yīng)[6]。

表3 黃柏70%乙醇粗提物和氨芐青霉素的聯(lián)合抑菌結(jié)果 Table 3 Combined inhibition results of 70% ethanol crude extract from cortex phellodendri and ampicillain

注:A藥為黃柏70%乙醇粗提物；B藥為氨芐青霉素。Note:"A" means the 70% ethanol crude extract of cortex phellodendri; "B" means ampicillain.

2.3 討論

黃柏70%乙醇粗提物與氨芐青霉素聯(lián)合使用時表現(xiàn)累加效應(yīng)，氨芐青霉素的MIC值下降到聯(lián)合用藥之前的1/2000，用量顯著減少?？茖W選擇中藥與西藥具有藥效互補、療效增強，降低細菌耐藥性的產(chǎn)生等優(yōu)點。

感染性疾病的發(fā)展進程與病原菌、宿主、藥物三者密不可分。藥物對癥，宿主免疫力強，則病原菌清除的速度就快。部分中草藥中的某些活性成分對病原微生物有直接抑制作用，如黃柏中的小檗堿已被證明在體外對多種革蘭氏陽性及陰性菌均具有抑菌作用[7]。本試驗采用70%乙醇回流提取法制備黃柏粗提液，主要目的是增加粗提液中小檗堿的含量。體外抗菌試驗在相對靜止條件下進行的，不受體內(nèi)復(fù)雜因素的影響，結(jié)果只能說明藥物對試驗菌的直接抑菌作用，因此MIC值對指導(dǎo)臨床用藥劑量有一定的參考價值。另外，部分中藥中的一些活性成分能調(diào)節(jié)機體平衡，增強免疫力，利于疾病治療。如果要全面評價中藥的治療效果，對動物免疫機能的影響也應(yīng)成為重要考察指標。