劉偲翔 ，黃 艷 ，蔣秀珍 ，柴 玲 ，賴茂祥 ，林 霄 ，劉布鳴 △

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧 530011； 2.廣西中醫(yī)藥研究院·廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530022）

一測多評(píng)（QAMS）是一種用于多成分質(zhì)量控制的分析方法，可解決中藥質(zhì)量控制中對(duì)照品短缺問題，降低中藥質(zhì)量控制分析成本。目前，該方法已成功應(yīng)用于黃連、木通、人參等20多種常用中藥的質(zhì)量控制評(píng)價(jià)。毛郁金為姜科植物毛郁金Curacuma aromaticaSalisb.的干燥根莖，其標(biāo)準(zhǔn)收載于《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)·第二卷》[1]，具有行氣解郁、涼血破瘀和利膽作用，用于治療胸悶脅痛、胃腹脹痛、黃疸、吐血、尿血、月經(jīng)不調(diào)和癲癇等病癥[2]。藥理試驗(yàn)證明，毛郁金具有鎮(zhèn)痛、止血[3]、抗炎[4]及免疫抑制[5]等作用。姜黃素類化合物是毛郁金藥材的主要活性成分，具有良好的抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降血糖、抗HIV功效，可治療心血管疾病和阿爾茨海默病等[6]。本課題組前期研究中已分離得到毛郁金中姜黃素、去甲氧基姜黃素等17個(gè)化合物，其中大部分為倍半萜化合物[7]，還含有揮發(fā)油等化合物[8-9]，并采用高效液相色譜（HPLC）法建立了毛郁金中姜黃素的含量測定方法[10]。但僅以姜黃素為指標(biāo)性成分對(duì)毛郁金藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，且其含量較低，尚不能真正體現(xiàn)和保證毛郁金的內(nèi)在本質(zhì)及其相關(guān)制劑的質(zhì)量。姜黃素和去甲氧基姜黃素為同一化學(xué)母核，在藥材中的相對(duì)含量相當(dāng)，為了更好地保證毛郁金的有效性、安全性和專屬性，故以兩者為指標(biāo)評(píng)價(jià)毛郁金質(zhì)量。本研究中采用一測多評(píng)法測定了毛郁金中姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量，以探討一測多評(píng)法在毛郁金多指標(biāo)質(zhì)量評(píng)價(jià)中的適用性和可行性?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS205型分析天平（梅特勒-托利多公司）；UC3282型高效液相色譜儀，UC3292型紫外檢測儀，均購于南寧威瑪龍色譜科技有限公司；Waters1525-1998型高效液相色譜儀（沃特世公司）；UV2550紫外可見分光光度儀（日本島津公司）。

試藥：姜黃素（純度 ＞98%，批號(hào)為 111530-201208），去甲氧基姜黃素對(duì)照品（純度＞98%，批號(hào)為111531-201208），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜級(jí)，賽默飛世爾科技有限公司），磷酸（分析純，廣州新建精細(xì)化工廠），其他試劑均為分析純；毛郁金Curacuma aromaticaSalisb.根莖采自廣西橫縣、靈山和南寧西郊，經(jīng)廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥研究員鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Ecosil ODS-Extemnd柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -4%磷酸溶液（42 ∶58，V∶V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：425 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按姜黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于5000，在此色譜條件下，可完全分離。該色譜條件下色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

取姜黃素對(duì)照品和去甲氧基姜黃素對(duì)照品適量，精密稱定，用甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度姜黃素為20.04μg/mL、去甲氧基姜黃素為19.96 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。取毛郁金根莖粉末1.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取1 h，放至室溫，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，再用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密吸取混合對(duì)照品溶液1，2，3，4，5，6 mL，分別置 10 mL容量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配成系列對(duì)照品溶液，以進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 毛郁金中2個(gè)姜黃素類成分回歸方程及線性范圍（n=6）

相對(duì)校正因子計(jì)算：取標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下制備的6個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，以姜黃素為內(nèi)標(biāo)，在上述特定范圍內(nèi)按照相對(duì)校正因子計(jì)算公式fis=fi/fs=（mi×As）/（ms×Ai）計(jì)算姜黃素對(duì)去甲氧基姜黃素的相對(duì)校正因子，其中i為某化合物，s為內(nèi)標(biāo)物，m為質(zhì)量，A為峰面積。結(jié)果見表2。

表2 不同濃度對(duì)照品溶液的相對(duì)校正因子（fA/B）

精密度試驗(yàn)：取同一供試品溶液，精密吸取10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積。結(jié)果姜黃素和去甲氧基姜黃素峰面積日內(nèi)精密度的RSD分別為1.50%和1.33%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10 h時(shí)進(jìn)樣，測定峰面積。結(jié)果姜黃素和去甲氧姜黃素面積的RSD分別為1.65%和1.38%（n=6），表明供試品溶液10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品粉末，依法制備供試品溶液6份，按色譜條件測定。結(jié)果姜黃素和去甲氧姜黃素的平均含量分別為0.111 3 mg/g和0.119 4 mg/g，RSD分別為1.76%和2.10%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的毛郁金根莖粉末約0.5 g，共6份，精密稱定，置平底燒瓶中，分別加入精密稱定的姜黃素 60.12 μg，去甲氧姜黃素對(duì)照品 59.88 μg，依法制備供試品溶液，進(jìn)樣測定。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 校正因子的重復(fù)性考察

色譜柱考察：取標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下系列混合對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣10 μL，以姜黃素為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算姜黃素對(duì)去甲氧基姜黃素的校正因子，考察Hypersil BDS C18柱、Ultimate XB-C18柱和ECOSIL ODS-3柱的影響。結(jié)果見表4。可見，不同色譜柱所得相對(duì)校正因子相差不大。

表4 不同色譜柱的相對(duì)校正因子（fA/B）

高效液相色譜考察：取上述混合對(duì)照品溶液，于Waters1525-1998型和威瑪龍UC3282-3292型高效液相色譜儀分別進(jìn)樣各10 μL，以姜黃素為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算姜黃素對(duì)去甲氧基姜黃素的校正因子，結(jié)果見表5，表明在不同液相色譜系統(tǒng)下所得的相對(duì)校正因子基本一致。

表5 不同高效液相色譜的相對(duì)校正因子

色譜峰專屬性考察：利用相對(duì)保留值（r=tR1/tR2）定位，即以待測組分與姜黃素色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間來確定。去甲氧基姜黃素與姜黃素峰的相對(duì)保留時(shí)間的平均值為1.111 7，RSD為1.54% （n=6）。結(jié)果見表6。

表6 2種成分的保留時(shí)間及相對(duì)保留時(shí)間

2.5 一測多評(píng)法與外標(biāo)法結(jié)果比較

取不同產(chǎn)地樣品粉末各1.0 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別采用一測多評(píng)法和外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見表7。

表7 不同產(chǎn)地毛郁金含量測定結(jié)果（mg/g，n=2）

3 討論

本研究中采用超聲、回流提取毛郁金藥材，結(jié)果顯示，兩者提取方式差異不明顯，而超聲提取方法簡單，故采用超聲提取?？疾炝思状肌?0%甲醇、50%乙醇作為毛郁金藥材的提取溶劑，結(jié)果表明用甲醇提取干擾雜質(zhì)較少，噪音少，因此選用甲醇為提取溶劑。提取時(shí)間考察了30，60，90，120 min，結(jié)果顯示，超聲提取 60 min 基本可將供試品溶液中的姜黃素和去甲氧基姜黃素提取完全，90 min后其含量有所下降，故確定提取時(shí)間為60 min。

參照2015年版《中國藥典（一部）》莪術(shù)中姜黃素含量測定方法[11]，以乙腈 -4%磷酸溶液（48∶52，V∶V）為流動(dòng)相洗脫，姜黃素特征峰未能與去甲氧基姜黃素特征峰較好地分離。此方法對(duì)于毛郁金藥材姜黃素與去甲氧基姜黃素的分離效果不理想。通過反復(fù)試驗(yàn)，選用乙腈-4%磷酸溶液（42∶58，V∶V）為流動(dòng)相，色譜峰峰形尖銳，姜黃素特征峰與去甲氧基姜黃素特征峰能較好分離，樣品檢測25 min完成，節(jié)省了試驗(yàn)成本和時(shí)間。

本研究首次采用“一測多評(píng)”法測定毛郁金藥材中姜黃素和去甲氧基姜黃素的含量，考察了不同品牌的色譜柱和色譜儀對(duì)姜黃素、去甲氧基姜黃素之間相對(duì)校正因子的影響，該方法與外標(biāo)法測得的含量無顯著性差異，說明建立的不同化合物之間的校正因子具有較高的可信度，可在僅有一個(gè)對(duì)照品時(shí)通過一測多評(píng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)同步測定藥材中多成分的指標(biāo)成分，為毛郁金藥材的多指標(biāo)質(zhì)量控制模式提供了新方法。