宋真 金炎 楊蕾 路超 白媛媛 郝瑩瑩

【摘要】目的 分析碳青霉烯類耐藥的大腸埃希菌（E.Coli）耐藥基因型與所含的毒力因子的關(guān)系。方法 PCR檢測(cè)E.Coli毒力因子和耐藥基因;采用Fisher確切概率法對(duì)耐藥基因和毒力因子的關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果 95.7%（22/23）菌株超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）基因陽(yáng)性，43.5%（10/23）菌株檢出胞外黏多糖相關(guān)基因，87.0%（20/23）菌株檢出P菌毛相關(guān)基因。耐藥基因CTX-M-15型比CTX-M-55型菌株攜帶毒力因子papGⅡ的概率低（P = 0.049）。耐藥基因NDM-1陽(yáng)性菌株比NDM-5陽(yáng)性菌株中毒力因子papGⅢ攜帶率高（P = 0.047）。 結(jié)論 ESBL陽(yáng)性菌株中不同CTX-M、NDM亞型與毒力因子papGⅡ、papGⅢ具有一定的相關(guān)性，毒力因子的攜帶情況與E.Coli耐藥情況可能有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】大腸埃希菌;毒力因子;耐藥基因;超廣譜β-內(nèi)酰胺酶;碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細(xì)菌

【Abstract】Objective To investigate the correlation between the genotype of drug-resistant genes and the virulence factors in carbapenem-resistant Escherichia coli（E.Coli） strains.? Methods The virulence factors and drug-resistant genes were detected by PCR. The relationship between drug resistance genes and virulence factors was analyzed by Fishers exact test.? Results A total of 95.7% （22/23） of the bacterial strains were positive for extended spectrum beta-lactamase （ESBLs） gene， 43.5% （10/23） positive for the extracellular polysaccharide-related genes， and 87.0% （20/23） positive for the P fimbriae-related genes. The positive rate of virulence factors papG Ⅱ in the CTX-M-15 strain was significantly lower compared with that in the CTX-M-55 strain （P = 0.049）. The positive rate of virulence factor papG Ⅲ in the NDM-5 positive strain was considerably higher than that in NDM-1 positive strains （P = 0.047）.? Conclusions The genotypes of CTX-M and NDM among ESBLs positive strains were asssociated with virulence factors papG Ⅱ or papG Ⅲ? virulence factors might be associated with the drug resistance genes in E.Coli.

【Key words】Escherichia coli;Virulence factor;Drug resistance gene;Extended spectrum beta-lactamase;Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae

大腸埃希菌（E.Coli）是引起醫(yī)院內(nèi)感染最常見的病原菌。根據(jù)致病力的不同，E.Coli可劃分為3大類：共生性、腸道內(nèi)致病性及腸道外致病的E.Coli[1]。主要引起泌尿系統(tǒng)感染的腸道外致病E.Coli稱為尿道致病性E.Coli，它具有可以躲避宿主免疫防御系統(tǒng)的致病因子，可以定植于泌尿系統(tǒng)黏膜上皮細(xì)胞，甚至侵入黏膜上皮細(xì)胞形成持留性的感染[2]。非復(fù)雜性尿路感染的菌株主要由低致病力的A群和B1群引起[3]。近年，B2群中出現(xiàn)了攜帶多種毒力因子及氟喹諾酮耐藥基因和超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBL）基因的菌株，這引起了全球的重視[4]。

碳青霉烯類藥物是對(duì)抗腸桿菌科多重耐藥菌株最有效的抗菌藥物，具有抗菌譜廣、殺菌活性大的特點(diǎn)。近年來，該類抗生素在臨床廣泛應(yīng)用，耐碳青霉烯類藥物的腸桿菌科細(xì)菌（CRE）正在逐漸增加。由于CRE同時(shí)也對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物以外的大部分常用抗生素耐藥，碳青霉烯類耐藥的高產(chǎn)毒株將給臨床治療帶來極大的挑戰(zhàn)，也為公共衛(wèi)生安全敲響警鐘。為了調(diào)查濟(jì)南地區(qū)碳青霉烯類耐藥E.Coli（CR-ECO）菌株中高致病力菌株的分布情況，課題組對(duì)本院2015年臨床分離的23株CR-ECO菌株進(jìn)行了耐藥基因、毒素基因擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化分群，并對(duì)耐藥基因與毒力因子的相關(guān)性進(jìn)行了分析。

材料與方法

一、材 料

1.菌株來源

2015年全年山東省立醫(yī)院共分離臨床感染患者來源的E.Coli 1 575株，剔除同一患者和同一部位的重復(fù)分離株，對(duì)于任一種碳青霉烯類藥物耐藥的E.Coli即認(rèn)為是CR-ECO，共檢出CR-ECO 38株，其中23株保留有菌種。所有菌株均采用梅里埃VITEK微生物鑒定儀進(jìn)行菌種鑒定，并采用生物梅里埃基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間微生物鑒定質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）對(duì)菌種進(jìn)行再次確認(rèn)。

2.主要試劑與儀器

VITEK-2 Compact 全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏系統(tǒng)（梅里埃公司，法國(guó)），時(shí)間飛行質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）（梅里埃公司，法國(guó)），Densichek比濁儀（梅里埃公司，法國(guó)），35 ℃細(xì)菌培養(yǎng)恒溫孵箱 （精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，上海），PCR儀（Applied Biosystems?，美國(guó)），Bio-Rad電泳儀（Bio-Rad公司，美國(guó)），黑馬GSG-2000凝膠成像拍照系統(tǒng) （黑馬醫(yī)學(xué)儀器，中國(guó)）。50×TBE 電泳緩沖液為自配，引物由上海生物工程有限公司合成，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系Premix Taq? 購(gòu)自大連寶生物（TAKARA，大連）有限公司，Gel-Red核酸染料、100 bp DNA Ladder、核酸瓊脂糖凝膠購(gòu)自百泰克公司。

二、方 法

1.碳青霉烯類耐藥表型篩選

按CLSI推薦的mCIM法篩選碳青霉烯類耐藥菌株。同時(shí)用E.Coli（ATCC 25922）和肺炎克雷伯菌5748分別作陰性和陽(yáng)性的質(zhì)控對(duì)照。

2. 菌株進(jìn)化分群

使用引物對(duì)ChuA、YjaA、TspE4C2.、TspE4Ⅱ片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物及退火溫度見參考文獻(xiàn)[5]。擴(kuò)增為陽(yáng)性的片段送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行一代測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中片段進(jìn)行在線BLAST比對(duì)，確認(rèn)為目標(biāo)片段。進(jìn)化分群的決策流程[2]。

3.毒力基因及ESBL基因檢測(cè)采用PCR擴(kuò)增

引物合成參照文獻(xiàn)[6-8] ，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。模板制備：EP管中加入1 ml去離子水，刮取黃豆粒大小對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期純培養(yǎng)菌苔置于管中，渦旋震蕩混勻，置于沸水浴中煮10 min。12 000×g離心10 min，上清液即為DNA模板，將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的EP管中，將模板DNA保存于-20℃冰箱備用。

耐藥基因的PCR檢測(cè)：碳青霉烯酶包括Ambler A組酶（blaNMC、blaKPC、blaSME、blaGES、blaIMI）、AmblerB組酶（blaNDM、blaIMP、blaSIM、blaVIM、blaGIM、laSPM）和Ambler D組酶（blaOXA）。其他β-內(nèi)酰胺酶包括除碳青霉烯以外的β-內(nèi)酰胺酶，包括AmpC酶（blaACC、blaACT、blaBIL、blaCMY、blaDHA、blaFOX、blaLAT、blaMIR和blaMOX）和ESBL（blaTEM、blaSHV、blaOXA、blaCTX-M）。反應(yīng)體系（25 μl）：上、下游引物各0.2 μmol /L，PCR反應(yīng)體系混合液10 μl，模板2 μl，加滅菌雙蒸水至20 μl。引物同參考文獻(xiàn)[7] 。每批PCR試驗(yàn)進(jìn)行陽(yáng)性和陰性質(zhì)控。

毒力因子的PCR檢測(cè)：毒素?cái)U(kuò)增通過5個(gè)多重PCR反應(yīng)完成。采用25 μl反應(yīng)體系，除了加*引物所采用的濃度為0.3 μM，其他引物的濃度均為0.6 μM。分為下面5個(gè)多重PCR反應(yīng)完成毒素基因擴(kuò)增[7-8]：①多重PCR反應(yīng)1：PAI、papA、 fimH、kpsMT Ⅲ、? papEF和ibeA;②多重PCR反應(yīng)2：fyuA、sfa/focDE、bmaE、papG allele Ⅲ、iutA和K1;③多重PCR反應(yīng)3：*nfaE、*papC、*papG allele Ⅰ、*kpsMT Ⅱ、rfc和hlyA;④多重PCR反應(yīng)4：gafD、cvaC、cdtB、 focG、traT和papG alleleⅡ;⑤多重PCR反應(yīng)5：*afa/draBC、*sfaS、*cnf1、papG alleleⅠ、papG allelesⅡ、papG alleles Ⅲ和K5.PCR產(chǎn)物電泳：配制1.5%瓊脂糖電泳凝膠，電泳緩沖液為0.5×TBE，吸取5 μl PCR產(chǎn)物上樣，所用電壓為110 V，電泳時(shí)間為40 min，用核酸染料染色后使用天能成像系統(tǒng)紫外燈下觀察并拍照。擴(kuò)增陽(yáng)性標(biāo)本測(cè)序確認(rèn)為目標(biāo)條帶。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用 SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定性資料組間比較采用Fisher確切概率法，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、大腸埃希菌菌株進(jìn)化分群情況

23株臨床菌株中有16株屬于B1群，3株屬于D群，4株屬于A群。沒有檢出B2群。具體情況見表1。

二、大腸埃希菌菌株所攜帶毒力因子情況

所有菌株均未檢出sfaS、sfa/focD、focG、gafD、afa/draBC、fimH、nfaE、cdtB、hlyA、cnf1、iut、fyuA、ibeA、rfc、pap AH、cvaC、pap EF、traT基因。共10株菌株檢出胞外黏多糖相關(guān)基因cps（kpsMTⅢ/kpsMTⅡ/K5）。攜帶有P菌毛papG基因菌株共20株，攜帶有papGⅡ的菌株共19株，檢出papGⅢ基因的菌株共11株。檢出P菌毛papC基因的菌株共3株，其中2株同時(shí)檢出papG和papC基因。3株菌株檢出致病島相關(guān)基因（PAI）。9株菌株檢出M型菌毛基因（bmaE）。7株檢出鐵獲得通路（iroN）基因。

三、E.Coli菌株所攜帶耐藥基因情況

23株菌株中共有20株NDM基因陽(yáng)性，12株為NDM-5亞型，6株為NDM-1亞型，1株為NDM-3亞型，1株為NDM-7亞型。22株攜帶ESBL基因，CTX-M和TEM為最常見的ESBL基因，經(jīng)過測(cè)序、BLAST比對(duì)進(jìn)一步明確CTX-M基因亞型和TEM基因亞型。19株所攜帶TEM基因均為產(chǎn)TEM-1亞型。檢出率最高的CTX-M亞型為CTX-M-14亞型，共13株;次之為CTX-M-15亞型，共6株，CTX-M-55亞型共6株。16株菌株同時(shí)檢出兩種以上ESBL基因，6株菌株同時(shí)檢出兩種亞型CTX-M基因。耐藥基因檢測(cè)匯總情況見表2。

四、E.Coli β內(nèi)酰胺耐藥基因與致病因子的相關(guān)性

各ESBL基因型菌株中攜帶cps、bmaE、papG Ⅲ、PAI、iroN、papC致病因子的概率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。攜帶CTX-M-15的菌株比攜帶CTX-M-55的菌株中papG Ⅱ陽(yáng)性率低（P = 0.049）。攜帶NDM-1菌株比攜帶NDM-5菌株中papG Ⅲ陽(yáng)性率高（P = 0.047）。具體結(jié)果見表3。

討論

系統(tǒng)分群是根據(jù)ChuA、YjaA、TspE4C2的不同組合對(duì)腸道外感染E.Coli進(jìn)行分子分型的重要方式，可分為A、B1、B2、D群，致病力大小從強(qiáng)到弱分別為B2、D、B1、A群[5， 9]。根據(jù)Ejrnaes等[6]的研究，B2群可以引起持續(xù)性尿路感染，具有較強(qiáng)的致病性。本次研究中的CRE菌株大部分屬于致病力較弱的B1群，小部分為A和D群，未檢出高致病力的B2群。盡管在本實(shí)驗(yàn)?zāi)退幘曛猩形礄z出高致病力的B2群菌株，但毒素?cái)U(kuò)增研究證實(shí)大部分菌株攜帶胞外多糖等多種毒力因子。尤其值得關(guān)注的是，檢出了3株D群菌株，表現(xiàn)為更強(qiáng)的黏附力和耐藥性。

細(xì)菌的致病性又稱為毒力，包括表面保護(hù)素、各類侵襲性酶和細(xì)菌毒素。其中，細(xì)菌侵襲性黏附、繼而感染的關(guān)鍵在于黏附因子的存在。菌毛與細(xì)菌的致病力密切相關(guān)，是黏附因子的重要組成部分。引起腎盂腎炎的大腸埃希菌中80%以上具有P菌毛，也就是腎盂腎炎相關(guān)性菌毛（P pili）[10]。根據(jù)受體的不同papG分為三型，其中Ⅰ型papG和Ⅱ型papG是人類特異性黏附素，主要導(dǎo)致人類腎盂腎炎，Prs菌毛也就是Ⅲ型papG，主要與膀胱炎和動(dòng)物感染相關(guān)[10]。本研究中的菌株，1株分離自血液，2株分離自胸腔積液，4株分離自尿道，3株分離自創(chuàng)面，6株分離自呼吸道，7株分離自腹腔，尿道和腹腔來源的菌株全部檢出papG基因，部分菌株同時(shí)檢出2種亞型papG基因。3株菌株未檢出papG基因，其中2株分離自呼吸道，1株分離自創(chuàng)面。上述結(jié)果證明在呼吸道、尿道感染和腹腔感染中papG均具有重要作用。

PAI位于細(xì)菌染色體上，是編碼致病因子的基因簇，兩端常攜帶插入元件或重復(fù)序列[11]。PAI通常攜帶分泌性蛋白或表面蛋白基因，例如溶血素和菌毛等。本實(shí)驗(yàn)中攜帶PAI基因的菌株中1例分離自血、1例分離自腹腔、1例分離自痰標(biāo)本。3株P(guān)AI陽(yáng)性菌株的M菌毛、papG Ⅱ和papG Ⅲ均陽(yáng)性，因此我們推測(cè)有更高的黏附力。鐵離子作為細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所必需的元素，有些細(xì)菌能夠直接從宿主細(xì)胞獲取鐵，這使得它們?cè)趷毫迎h(huán)境下有更強(qiáng)的適應(yīng)能力并使毒力增強(qiáng)。研究證實(shí)，分離自雞的攜帶CTX-M-9亞群E.Coli中，iroN基因的檢出率顯著高于攜帶CTX-M-1基因亞群和不攜帶CTX-M基因的菌株。本研究中，各ESBL基因亞型菌株中iroN的檢出率相近。

綜上所述，我院最常見的ESBL基因?yàn)镃T- X-M-15、CTX-M-14、CTX-M-55。ESBL基因和致

病基因相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，NDM-1陽(yáng)性菌株比NDM-5陽(yáng)性菌株容易檢出papG Ⅲ基因，papG Ⅱ基因檢出率在CTX-M-15陽(yáng)性菌株中低于CTX-M-55陽(yáng)性菌株。由于本實(shí)驗(yàn)涉及菌株數(shù)量較少，E.Coli中致病基因和耐藥基因的相關(guān)性尚待進(jìn)一步確認(rèn)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Foxman B. Epidemiology of urinary tract infections： incidence， morbidity， and economic costs. Am J Med，2002，113（Suppl 1A）：5S-13S.

[2] Clermont O， Bonacorsi S， Bingen E. Rapid and simple determin-ation of the Escherichia coli phylogenetic group. Appl Environ Microbiol，2000，66（10）：4555-4558.

[3] Ho PL， Lo WU， Lai EL， Chow KH， Yam WC. Escherichia coli O25b-ST131 is an important cause of antimicrobial-resistant infections in women with uncomplicated cystitis. J Antimicrob Chemother，2012，67（10）：2534-2535

[4] Liu X， Liu H， Wang L， Peng Q， Li Y， Zhou H， Li Q. Molecular characterization of extended-spectrum beta-lactamase-producing multidrug resistant Escherichia coli from swine in Northwest China. Front Microbiol，2018，9：1756.

[5] Pitout JD， Laupland KB， Church DL， Menard ML， Johnson JR.Virulence factors of Escherichia coli isolates that produce CTX-M-type extended-spectrum beta-lactamases. Antimicrob Agents Chemother，2005，49（11）：4667-4670.

[6] Ejrn?s K， Stegger M， Reisner A， Ferry S， Monsen T， Holm SE， Lundgren B， Frimodt-M?ller N. Characteristics of Escheri-chia coli causing persistence or relapse of urinary tract infections：phylogenetic groups， virulence factors and biofilm formation.Virulence，2011，2（6）：528-537.

[7] Colom K， Pérez J， Alonso R， Fernández-Aranguiz A， Lari?o E， Cisterna R. Simple and reliable multiplex PCR assay for detection of blaTEM， blaSHV and blaOXA-1 genes in Enterobacteriaceae. FEMS Microbiol Lett，2003，223（2）：147-151.

[8] Poirel L， Walsh TR， Cuvillier V， Nordmann P. Multiplex PCR for detection of acquired carbapenemase genes. Diagn Microbiol Infect Dis，2011，70（1）：119-123.

[9] Manges AR， Johnson JR， Foxman B， OBryan TT， Fullerton KE， Riley LW. Widespread distribution of urinary tract infections caused by a multidrug-resistant Escherichia coli clonal group. N Engl J Med，2001，345（14）：1007-1013.

[10] Graveline R， Lavoie R， Garneau P， Daigle F， Sénéchal S， Martin C， Harel J. Monitoring F1651 P-like fimbria expression at the single-cell level reveals a highly heterogeneous phenotype. Infect Immun，2015，83（5）：1929-1939.

[11] Barrios-Villa E， Cortés-Cortés G， Lozano-Zaraín P， Arenas-Hernández MMP， Martínez de la Pe?a CF， Martínez-Laguna Y， Torres C， Rocha-Gracia RDC. Adherent/invasive Escherichia coli （AIEC） isolates from asymptomatic people： new E. coli ST131 O25：H4/H30-Rx virotypes. Ann Clin Microbiol Antimicrob，2018，17（1）：42.

（收稿日期：2018-12-28）

（本文編輯：楊江瑜）