王進(jìn) 董曉強(qiáng) 趙鑫 朱新國 趙華 張江磊

【摘要】目的 建立穩(wěn)定過表達(dá)IL-9的小鼠CT-26腫瘤細(xì)胞株及BALB/C小鼠皮下移植瘤模型，為后續(xù)研究IL-9在結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中的作用及其機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法 將目的基因IL-9片段插入帶有綠色熒光蛋白（GFP）的慢病毒載體GV492，構(gòu)建重組過表達(dá)IL-9-GV492質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，用倒置熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)強(qiáng)度，用蛋白免疫印跡法檢測IL-9的表達(dá);包裝病毒后檢測病毒滴度。將過表達(dá)IL-9的慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞后，用倒置熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)強(qiáng)度，用流式細(xì)胞儀檢測GFP及IL-9的表達(dá)，用qRT-PCR法檢測IL-9的mRNA表達(dá)。過表達(dá)IL-9的CT-26細(xì)胞皮下接種BALB/C小鼠建立皮下移植瘤模型后，用免疫組化法檢測腫瘤中IL-9的蛋白表達(dá)，用qRT-PCR法檢測IL-9的mRNA表達(dá)。結(jié)果 陽性重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約617 bp，DNA測序顯示重組質(zhì)粒的編碼序列與目標(biāo)序列完全一致。293T細(xì)胞自身不表達(dá)IL-9，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后表達(dá)IL-9;慢病毒滴度為2×109 TU/ml。慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞后，Control組、LV-NC組、LV-IL-9組GFP表達(dá)陽性率分別為0、96.4%、91.2%;LV-IL-9組IL-9的MFI及mRNA的表達(dá)均高于LV-NC組（P均< 0.05）。BALB/C小鼠皮下移植瘤模型建立后，實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤IL-9的陽性表達(dá)率及mRNA的表達(dá)均高于陰性對照組（P均< 0.05）。結(jié)論 穩(wěn)定過表達(dá)IL-9的小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞株及BALB/C小鼠皮下移植瘤模型建立成功。

【關(guān)鍵詞】慢病毒轉(zhuǎn)染;IL-9基因;CT-26腫瘤細(xì)胞;BALB/C小鼠;異種移植瘤模型

【Abstract】Objective To construct the CT-26 cell lines stably over-expressing IL-9 gene and establish the BALB/C mouse models with subcutaneous xenograft， aiming to provide experimental basis for further study of the function and mechanism of IL-9 in the tumor microenvironment of colon cancer.? Methods The IL-9 gene fragment was inserted into the lentiviral plasmid GV492 which carried green fluorescent protein （GFP） to establish the recombinant IL-9-GV492. After the 293T cells were transfected， the expression intensity of GFP was observed under an inverted fluorescence microscope and the expression level of IL-9 was measured by Western blot. The virus titer was detected after packaging the lentiviral vectors. After the lentivirus over-expressing IL-9 were transfected with the CT-26 cells， the expression intensity of GFP was observed under an inverted fluorescence microscope. The expression levels of GFP and IL-9 were measured by flow cytometry. The expression level of IL-9 mRNA was measured by qRT-PCR. The BALB/C mouse models with subcutaneous xenograft were established by subcutaneous inoculation of IL-9-CT-26 cells. The expression level of IL-9 protein in the tumors was detected immunohistochemistry， and the expression level of IL-9 mRNA was measured by qRT-PCR. Results The PCR amplified product of positive recombinant plasmid was approximately 617 bp in size. DNA sequencing demonstrated that the coding sequence of the recombinant plasmid was completely consistent with the designed sequence. The 293T cells didnt express IL-9， whereas expressed IL-9 after the cells were transfected with the recombinant plasmid. The virus titer of the packaged lentivirus was 2×109 TU/ml. After the CT-26 cells were transfected with the lentivirus over-expressing IL-9， the positive expression rates of GFP in the control， LV-NC and LV-IL-9 groups were 0， 96.4% and 91.2%， respectively. The IL-9 expression （MFI） and IL-9 mRNA in the LV-IL-9 group were significantly higher than those in the LV-NC group（all P < 0.05）. After the BALB/C mouse models with subcutaneous xenograft model were established， the expression rate of IL-9 and the expression level of IL-9 mRNA in the experimental group were significantly higher compared with those in the control group（all P < 0.05）.? Conclusions The CT-26 cell lines stably over-expressing IL-9 gene and the BALB/C mouse models with subcutaneous xenograft model are successfully established.

【Key words】Lentiviral transfection;IL-9 gene;CT-26 cell;BALB/C mouse;Xenograft model

結(jié)腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率居于第3位[1]。在我國，結(jié)腸癌的發(fā)病率及病死率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，每年因結(jié)腸癌死亡人數(shù)在惡性腫瘤中居于第5位[2]。結(jié)腸癌除傳統(tǒng)的手術(shù)、化學(xué)治療及放射治療等治療方式，免疫基因治療逐漸呈現(xiàn)其優(yōu)越性，因此尋找免疫治療的新策略對于結(jié)腸癌的治療至關(guān)重要[3-4]。

IL-9最早于1988年由Uyttenhove等在建立的多個Th2細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)，主要來源于活化的Th9細(xì)胞，近年來逐漸發(fā)現(xiàn)IL-9具有抗腫瘤免疫作用[5-6]。研究通過建立小鼠黑色素瘤、鱗癌模型及Th9抗原特異性疫苗，發(fā)現(xiàn)IL-9表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用且可抑制腫瘤細(xì)胞的種植及擴(kuò)散[7-10]。Huang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，IL-9在結(jié)腸癌患者的癌組織及血漿中均呈低表達(dá)，且IL-9與結(jié)腸癌TNM分期關(guān)系密切，提示IL-9低表達(dá)與結(jié)腸癌進(jìn)展相關(guān)。IL-9作為一個潛在的免疫基因靶點(diǎn)，對于指導(dǎo)結(jié)腸癌的基礎(chǔ)和臨床研究以及免疫基因治療具有重要意義。本研究旨在建立穩(wěn)定過表達(dá)IL-9的小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞株以及BALB/C小鼠皮下移植瘤模型，為后續(xù)研究IL-9在結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中的抗腫瘤免疫作用及其機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

材料與方法

一、過表達(dá)IL-9-GV492慢病毒載體的構(gòu)建

環(huán)狀慢病毒質(zhì)粒載體GV492攜帶綠色熒光蛋白（GFP）及BamHI/AgeI酶切位點(diǎn)，利用限制性內(nèi)切酶（NEB公司）獲得線性化載體，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并回收目的條帶;GV492載體，BamHI/AgeI 酶切，購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司。從購買的cDNA文庫中利用反轉(zhuǎn)錄PCR法獲取鼠源性實(shí)驗(yàn)?zāi)康幕騃L-9，由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)引物，引物均含BamHI/AgeI酶切位點(diǎn)，其序列為：IL-9-F，5-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTG-3;IL-9-R，5-TCCTTGTAGTCCATACCTGGTCGGCTTTTCTGCCTTTGC-3。按照如下反應(yīng)條件：98℃5 min循環(huán)1次，98℃10 s、55℃10 s、72℃90 s循環(huán)30次，72℃8 min循環(huán)1次進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因片段，擴(kuò)增產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。將PCR產(chǎn)物與線性化載體在37℃反應(yīng)30 min，冰水浴中冷卻5 min進(jìn)行重組反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)線性化載體和目的基因IL-9片段的體外環(huán)化;隨后將重組產(chǎn)物加入到感受態(tài)大腸桿菌菌株DH5α中，并在LB培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

挑取單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定，引物序列為：F，5-GGGTCAATATGTAATTTTCAGTG-3;R，5-CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3。按照如下反應(yīng)條件：94℃3 min循環(huán)1次，94℃30 s、55℃30 s、

72℃30 s循環(huán)22次，72℃5 min循環(huán)1次進(jìn)行PCR，產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定，空白對照以ddH20為模版，陰性對照以未插入目的基因的空載體為模版，陽性對照以含有GAPDH基因?yàn)槟０濉㈣b定的陽性克隆接種于含抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12 ～ 16 h后取適量菌液測序及結(jié)果分析。隨后將測序正確的菌液用無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒（Qiagen公司）抽提質(zhì)粒，獲得高純度質(zhì)粒，用于下游病毒包裝。

二、質(zhì)粒表達(dá)檢測、慢病毒包裝和病毒滴度檢測

轉(zhuǎn)染前24 h，將處于對數(shù)生長期的慢病毒包裝細(xì)胞293T以含10%血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度約5×109/15 ml，并接種于10 cm培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng)。將抽提的質(zhì)粒DNA溶液（包括目的基因質(zhì)粒、陰性對照、陽性對照）轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，培養(yǎng)6 h后棄去含轉(zhuǎn)染混合物的培養(yǎng)基，以含10%血清的培養(yǎng)基于37℃、含5%CO2的環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)48 ～ 72 h。轉(zhuǎn)染后48 h，用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的熒光表達(dá)強(qiáng)度并拍照。同時收集293T細(xì)胞用蛋白免疫印跡法檢測目的基因IL-9的表達(dá)情況;SDS-PAGE分離膠濃度為10 %，蛋白上樣量為20 ?g;IL-9一抗購于Sigma公司，稀釋比例為1∶3 000，二抗購于santa-cruz公司，稀釋比例為1∶4 000;最后用ECL成像系統(tǒng)ECL法結(jié)合X線片曝光、成像，觀察3組條帶的不同。

獲得預(yù)期檢測結(jié)果后，收集294T細(xì)胞上清液，離心去除細(xì)胞碎片，超速離心濃縮后，加入病毒保存液或細(xì)胞培養(yǎng)基，充分溶解離心后，去上清將病毒原液進(jìn)行分裝、保存。同時準(zhǔn)備樣本進(jìn)行病毒滴度的檢測，測定前1 d，將293T細(xì)胞按4×109/孔鋪于96孔板，按照設(shè)置的梯度濃度加入病毒原液，培養(yǎng)4 d后用倒置熒光顯微鏡觀察熒光的表達(dá)情況，按公式：病毒滴度=熒光細(xì)胞數(shù)/病毒原液量計(jì)算病毒滴度。

三、穩(wěn)定過表達(dá)IL-9的小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞的建立

取對數(shù)生長期的小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞，用含10%FBS（四季青生物制品公司）的1 640完全培養(yǎng)基（Hyclone公司）制成3×104 ～ 5×104/ml的細(xì)胞懸液。根據(jù)轉(zhuǎn)染病毒的不同將細(xì)胞分為3組，分別為：空白對照組（Control組）、陰性對照組（LV-NC組）和實(shí)驗(yàn)組（LV-IL-9組）。按照上述分組分別接種5×104個細(xì)胞于6孔板中，接種體積為2 ml，待細(xì)胞融合度約30%時，加入10 μl的1×108 TU/ml的慢病毒液（空白對照組不加病毒，陰性對照組加入IL-9陰性病毒，實(shí)驗(yàn)組加入過表達(dá)IL-9病毒），慢病毒轉(zhuǎn)染12 h后換回常規(guī)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，途中根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)進(jìn)行換液，轉(zhuǎn)染48 h后應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察3組感染效率并拍照。

若感染效率達(dá)80%以上，即應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測3組細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染陽性率（GFP）及實(shí)驗(yàn)組和對照組IL-9表達(dá)情況。將3組細(xì)胞消化、離心、重懸后，室溫、暗室、固定20 min，破膜，加入IL-9抗體（上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司），抗體與100μl的1×Perm Wash Buffer按1∶100使用，4℃、避光，孵育30 min，離心后棄上清，Hanks重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至流式管上流式細(xì)胞儀檢測。

同時，用qRT-PCR法檢測3組細(xì)胞中IL-9的mRNA表達(dá)情況。提取3組細(xì)胞的總RNA后，使用Prime ScriptRT Master 試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)程序：37℃ 15 min，85℃ 15 s，4℃ 1 min，使RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，反應(yīng)程序：95℃ 5 min，95℃10 s，60℃ 30 s，共40個循環(huán)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)儀器自動計(jì)算所得每組標(biāo)本的Ct值，計(jì)算目的基因mRNA的相對表達(dá)量2-ΔΔCt，△△Ct=實(shí)驗(yàn)組△Ct -對照組△Ct，△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參Ct值。引物序列如下：IL-9-F，5-CTCTGTTTGGGCATTCCCTCT-3，IL-9-R，5-GGGTATCTTGTTTGCATGGTGG-3;GAPDH -F，5-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3，GAPDH-R，5-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3。

四、BALB/C小鼠皮下移植瘤模型的建立

取對數(shù)生長期的過表達(dá)IL-9（實(shí)驗(yàn)組）和不表達(dá)IL-9（陰性對照組）的慢病毒轉(zhuǎn)染后的小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞，分別移入75 ml培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，待細(xì)胞長滿予PBS重懸制成2×107/ml的細(xì)胞懸液。取6周齡BALB/C雌性小鼠12只，實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組各6只，將50 ?l細(xì)胞懸液（約 10×105個細(xì)胞）混勻后用1 ml注射器行右側(cè)腹部皮下種植，2組小鼠做好標(biāo)記，于蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心SPF級飼養(yǎng)。第26日用頸椎脫臼法處死小鼠，于無菌環(huán)境中取出腫瘤。實(shí)驗(yàn)過程符合倫理學(xué)規(guī)定。

腫瘤分為2份：1份予以10%甲醛溶液固定，石蠟切片，備做免疫組織化學(xué)（組化）。融蠟、脫蠟、脫水，檸檬酸緩沖液沖洗，滅活內(nèi)源性過氧化物酶，3%BSA避光孵育30 min，滴加IL-9一抗（按1∶200稀釋），避光4℃孵育過夜。加二抗，DAB染色，蘇木精復(fù)染，梯度濃度乙醇脫水，中性樹脂封片，倒置顯微鏡下觀察2組腫瘤IL-9表達(dá)情況并拍照。一抗、二抗均購于Abcam公司。IL-9主要在正常細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，以棕黃色顆粒為染色陽性。隨機(jī)選擇10個400倍視野，計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞所占比例并計(jì)分：< 5%計(jì)0分，5% ～ 35%計(jì)1分（含35%），35% ～ 70%計(jì)2分（不含35%），> 70%計(jì)3分;同時按染色強(qiáng)度計(jì)分：未顯色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，黃棕色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。免疫組化結(jié)果以陽性染色細(xì)胞比例與染色強(qiáng)度的乘積結(jié)果判定：< 2分為IL-9表達(dá)陰性，≥2分為IL-9表達(dá)陽性。

另1份腫瘤立即保存于-80℃冰箱，準(zhǔn)備做qRT-PCR，實(shí)驗(yàn)步驟同上。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn);多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，兩兩比較時采用LSD-t檢驗(yàn)。定性資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、過表達(dá)IL-9-GV492慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

環(huán)狀慢病毒質(zhì)粒載體GV492經(jīng)BamHI/AgeI 酶切，獲得線性化載體，其酶切電泳圖。目的基因IL-9片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小約485 bp，符合預(yù)期結(jié)果。陽性對照組質(zhì)粒擴(kuò)增可見片段條帶，空白對照及陰性對照組未見質(zhì)粒擴(kuò)增片段，重組質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小約617bp。陽性克隆DNA測序與目的基因序列比對分析的結(jié)果為：重組質(zhì)粒的編碼序列與目標(biāo)序列完全一致，說明過表達(dá)IL-9-GV492慢病毒載體的構(gòu)建成功。

二、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞的熒光和蛋白表達(dá)以及慢病毒滴度

過表達(dá)IL-9質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)可見明顯的熒光，觀察視野內(nèi)攜帶綠色熒光的細(xì)胞約在90%以上，說明目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染正常、目的質(zhì)?；驘晒獗磉_(dá)正常。蛋白免疫印跡法發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞表達(dá)IL-9，34 kDa附近存在特異性條帶，而293T細(xì)胞本身不表達(dá)IL-9 ，說明重組質(zhì)粒過表達(dá)IL-9基因。慢病毒滴度結(jié)果為2×109 TU/ml。

三、穩(wěn)定過表達(dá)IL-9的小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞的建立及鑒定

倒置熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染后CT-26細(xì)胞：Control組細(xì)胞無熒光表達(dá)，LV-NC組及LV-IL-9組觀察視野內(nèi)攜帶綠色熒光的細(xì)胞均約在90%以上。Control組、LV-NC組、LV-IL-9組GFP表達(dá)陽性率分別為0、96.4%、91.2%，LV-IL-9組IL-9的平均熒光強(qiáng)度（MFI）高于LV-NC組，即LV-IL-9組過表達(dá)IL-9，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.947，P < 0.01）。以LV-IL-9組IL-9的mRNA表達(dá)量均值為1，則LV-IL-9組IL-9的mRNA相對表達(dá)量（1.000±0.203）高于LV-NC組（0.189±0.078）和Control組（0.227±0.132），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.001）;而LV-NC組和Control組的mRNA相對表達(dá)量相近（P > 0.05）。說明穩(wěn)定過表達(dá)IL-9的小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞的建立成功。

四、建立BALB/C小鼠皮下移植瘤模型

LV-IL-9組和LV-NC組的小鼠成瘤率均為100%。與LV-NC組小鼠相比，LV-IL-9組小鼠腫瘤的生長速度較慢，最終瘤體較小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。免疫組化顯示LV-IL-9組小鼠腫瘤IL-9的陽性表達(dá)率（100%）高于LV-NC組（33.3%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2= 6.000，P=0.014）。以LV-IL-9組IL-9的mRNA表達(dá)量均值為1，則LV-IL-9組IL-9的mRNA相對表達(dá)量（1.000±0.178）高于LV-NC組（0.375±0.106），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t = 9.060，P?< 0.001）。說明過表達(dá)IL-9小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞BALB/C小鼠皮下移植瘤模型建立成功。

討論

基因治療是以人的遺傳基因?yàn)檠芯炕A(chǔ)的新興疾病治療方法，其通過將正常有功能的基因引入到靶細(xì)胞用以補(bǔ)償或糾正致病的缺陷基因，最終達(dá)到治療疾病的目的[12-13]。從20世紀(jì)七八十年代開始，隨著DNA重組及基因克隆技術(shù)的成熟和發(fā)展，基因治療逐漸顯示出其治療疾病的優(yōu)越性，并成為當(dāng)前熱門的疾病治療方法和研究熱點(diǎn)[14]。腫瘤免疫治療是指通過激發(fā)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，從而達(dá)到控制和殺滅腫瘤細(xì)胞的目的[15]。而腫瘤的免疫基因治療是通過外源性向腫瘤或體細(xì)胞內(nèi)引入某些細(xì)胞因子基因或共刺激分子基因，激發(fā)或調(diào)動機(jī)體的免疫功能以最終治療腫瘤，因其具有安全性及有效性等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前腫瘤免疫研究和治療中常見的方法[16]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-9通過誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞的活化，產(chǎn)生抗腫瘤免疫應(yīng)答，從而抑制腫瘤生長，顯示出強(qiáng)大的抗腫瘤免疫作用。IL-9作為新型免疫基因靶點(diǎn)，對于結(jié)腸癌的免疫基因治療具有重要研究價(jià)值。

基因載體是基因治療中的運(yùn)載工具，可將目的基因?qū)胨拗骷?xì)胞進(jìn)行復(fù)制或表達(dá)。脂質(zhì)體等非病毒載體作為基因轉(zhuǎn)染的工具有轉(zhuǎn)染效率低且無法長期表達(dá)等缺點(diǎn)，因此本研究采用慢病毒載體，其以HIV為基礎(chǔ)，可感染分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞，除了具有在體力長期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)外，當(dāng)慢病毒載體感染目的細(xì)胞后，不會再感染其他細(xì)胞且不會利用宿主細(xì)胞產(chǎn)生新的病毒顆粒，安全系數(shù)極高。本研究所用的慢病毒載體系統(tǒng)由GV492、pHelper 1.0載體和pHelper 2.0載體等3種質(zhì)粒所組成，載體中除了含有HIV的基本元件5LTR和3LTR外，還有攜帶綠色熒光標(biāo)記的GFP、BamHI/AgeI 酶切位點(diǎn)和嘌呤霉素抗性。

本研究將酶切后的線性化載體和PCR擴(kuò)增的IL-9基因產(chǎn)物進(jìn)行體外環(huán)化，重組轉(zhuǎn)化后成功獲得IL-9-GV492重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，GFP表達(dá)效率高，且有效地過表達(dá)IL-9，慢病毒滴度達(dá)2×109 TU/ml，說明過表達(dá)IL-9的慢病毒構(gòu)建成功。過表達(dá)IL-9的慢病毒轉(zhuǎn)染小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，LV-IL-9組和LV-NC組的GFP表達(dá)率明顯高于Control組，且LV-IL-9組IL-9的表達(dá)明顯高于LV-NC組，說明慢病毒轉(zhuǎn)染CT-26細(xì)胞成功，且轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞過表達(dá)IL-9。過表達(dá)和不表達(dá)IL-9-CT-26細(xì)胞皮下種植BALB/C小鼠，以第26日作為觀察點(diǎn)，過表達(dá)IL-9組的小鼠腫瘤陽性表達(dá)IL-9，而陰性對照組的小鼠腫瘤陰性表達(dá)IL-9，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明BALB/C小鼠皮下移植瘤模型建立成功。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)成功建立穩(wěn)定過表達(dá)IL-9的小鼠結(jié)腸癌CT-26細(xì)胞株及BALB/C小鼠皮下移植瘤模型，為進(jìn)一步研究IL-9在結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中的作用及其機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 曾一文，黎潔瑤，田曠怡， 于濤，許稷豪，陳其奎.通過AOM及AOM聯(lián)合DSS建立C57BL/6J小鼠結(jié)腸癌誘導(dǎo)模型的對比研究.新醫(yī)學(xué)，2018，49（10）：720-725.

[2] Chen W， Zheng R， Baade PD，Zhang S， Zeng H， Bray F， Jemal A， Yu XQ， He J. Cancer statistics in China，2015. CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.

[3] Naldini L. Gene therapy returns to centre stage. Nature，2015， 526（7573）：351-360.

[4] Yang Y. Cancer immunotherapy： harnessing the immune system to battle cancer. J Clin Invest， 2015， 125（9）：3335-3337.

[5] Uyttenhove C， Simpson RJ， Van Snick J. Functional and structural characterization of P40， a mouse glycoprotein with T-cell growth factor activity. Proc Natl Acad Sci U S A， 1988， 85（18）：6934-6938.

[6] Nakatsukasa H， Zhang D， Maruyama T， Chen H， Cui K， Ishikawa M， Deng L， Zanvit P， Tu E， Jin W， Abbatiello B， Goldberg N， Chen Q， Sun L， Zhao K， Chen W. The DNA-binding inhibitor Id3 regulates IL-9 production in CD4（+） T cells. Nat Immunol， 2015，16（10）：1077-1084.

[7] Purwar R， Schlapbach C， Xiao S， Kang HS， Elyaman W， Jiang X， Jetten AM， Khoury SJ， Fuhlbrigge RC， Kuchroo VK， Clark RA， Kupper TS. Robust tumor immunity to melanoma mediated by interleukin-9-producing T cells. Nat Med， 2012， 18（8）： 1248-1253.

[8] Lu Y， Hong S， Li H， Park J， Hong B， Wang L， Zheng Y， Liu Z， Xu J， He J， Yang J， Qian J， Yi Q. Th9 cells promote antitumor immune responses in vivo. J Clin Invest，2012，122（11）：4160-4171.

[9] Miao BP， Zhang RS， Sun HJ， Yu YP， Chen T， Li LJ， Liu JQ， Liu J， Yu HQ， Zhang M， Liu ZG， Yang PC.Inhibition of squamous cancer growth in a mouse model by Staphylococcal enterotoxin B-triggered Th9 cell expansion. Cell Mol Immunol，2017，14（4）：371-379.

[10] Abdul-Wahid A， Cydzik M， Prodeus A， Alwash M， Stanojcic M， Thompson M， Huang EH， Shively JE， Gray-Owen SD， Gariépy J. Induction of antigen-specific TH 9 immunity accompanied by mast cell activation blocks tumor cell engraftment. Int J Cancer， 2016，139（4）：841-853.

[11] Huang Y， Cao Y， Zhang S， Gao F. Association between low expression levels of interleukin-9 and colon cancer progression. Exp Ther Med， 2015， 10（3）：942-946.

[12] Touzot F， Hacein-Bey-Abina S， Fischer A， Cavazzana M. Gene therapy for inherited immunodeficiency. Expert Opin Biol Ther， 2014， 14（6）：789-798.

[13] Misra S. Human gene therapy： a brief overview of the genetic revolution. J Assoc Physicians India， 2013， 61（2）：127-133.

[14] Kaufmann KB， Büning H， Galy A， Schambach A， Grez M. Gene therapy on the move. EMBO Mol Med， 2013， 5（11）：1642-1661.

[15] Tang H， Qiao J， Fu YX. Immunotherapy and tumor microe-nvironment. Cancer Lett， 2016， 370 （1）： 85-90.

[16] Luo M， Liang X， Luo ST， Wei XW， Liu T， Ren J， Ma CC， Yang YH， Wang BL， Liu L， Song XR， He ZY， Wei YQ. Folate-modified lipoplexes delivering the interleukin-12 gene for targeting colon cancer immunogene therapy. J Biomed Nanotechnol， 2015， 11（11）：2011-2023.

（收稿日期：2018-12-18）

（本文編輯：楊江瑜）