李凌志 劉璇 劉洋 徐愛玲 宋志文

摘?要：通過對海洋環(huán)境污泥進行富集培養(yǎng)及分離篩選得到一株光合細菌，通過16S rDNA全序列分析，結(jié)合菌株形態(tài)和結(jié)構(gòu)，鑒定其為Ectothiorhodospira magna。研究表明菌株在鹽度30‰、28 ℃、DO 8 mg/L的條件下，對初始濃度分別為280、84、98 mg/L的氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮經(jīng)過10 d處理的去除率分別為81.83%、46.21%、86.79%。在氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮共存的環(huán)境下，菌株首先利用氨氮，之后將亞硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化成硝酸鹽氮。

關(guān)鍵詞：光合細菌;分離篩選;菌種鑒定;無機氮;去除效果

光合細菌（Photosynthethetic Bacteria，PSB）是地球上最早出現(xiàn)的，具有原始光能合成體系不產(chǎn)氧細菌的統(tǒng)稱[1]，主要包括紅螺菌科（Rhodopseudomonas）、著色菌科（Chromatiaceae）、外硫紅菌科（Ectothiorhodosperilaceae）、綠硫細菌科（Chlorobiaceae）、綠色絲狀菌科（Chloroflexaceae）、螺旋桿菌科（Helibacteriaceae）以及含細菌葉綠素a的好氧菌（Bacteriochlorophylla-containing aerobic bacteria）等七大類[2]。由于光合細菌能夠去除養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽等有毒物質(zhì)，并且不消耗水體中氧，而且其本身也含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和光合色素等營養(yǎng)物質(zhì)，亦可以作為幼蝦的單細胞蛋白來源，以此顯著增強養(yǎng)殖動物的免疫水平，以提高其成活率，很快成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用最多的微生物之一[3]。

本研究從青島海泊河入?？诘啄嘀蟹蛛x篩選出一株光合細菌，通過分析其16S rDNA全序列并結(jié)合菌株細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)、菌液的吸收特征波峰、碳源利用情況對菌株進行鑒定，研究菌株對無機氮的轉(zhuǎn)化能力。

1?材料與方法

1.1?實驗材料

污泥來源：污泥取自青島海泊河入?？诎哆?，距地表面20 cm，距離海泊河污水廠排污口500 m左右。

培養(yǎng)基：采用光合細菌富集培養(yǎng)基及RCVBN培養(yǎng)基[4]。

1.2?實驗方法

1.2.1?光合細菌的富集培養(yǎng)?取2 g污泥裝入100 mL試管中，加入富集培養(yǎng)基95 mL，再加入2 mL液體石蠟以隔絕空氣。將其置于光照恒溫培養(yǎng)箱中，在30 ℃、光照2 000 lx的條件下富集培養(yǎng)，當液體培養(yǎng)基變成紅色后，取10 mL的菌液，裝入滅菌50 mL玻璃具比色管中，再次富集，直到菌液顏色變?yōu)樯罴t色為止。

1.2.2?菌株的分離純化及擴大培養(yǎng)?從富集培養(yǎng)物當中取1 mL，按照10-4到10-6成梯度稀釋，分別均勻涂布在RCVBN固體培養(yǎng)基（RCVBN培養(yǎng)液中加入2%瓊脂）上，將涂布好的斜面培養(yǎng)基放于生化光照培養(yǎng)箱，在溫度30 ℃、光照強度3 000 lx條件下 ，培養(yǎng)7 d，待斜面培養(yǎng)基表面長出紅色菌落后，挑取該菌落至新的RCVBN固體培養(yǎng)基的斜面上劃線，再將其重新放回生化光照培養(yǎng)箱，同樣的培養(yǎng)條件再培養(yǎng)7 d，重復(fù)3次，直到培養(yǎng)出純菌為止，將純種的菌株穿刺接種，放入冰箱保存。

將50 mL螺口試管作為菌種的活化容器，加入45 mL RCVBN培養(yǎng)基，把菌株接種到培養(yǎng)基當中，接種后將螺口試管的螺帽擰緊，溫度30 ℃、光照強度3 000 lx條件下厭氧培養(yǎng)，待試管中的液體變?yōu)樯罴t色（OD660≥1.5）。

1.2.3?菌株形態(tài)及生理生化性質(zhì)研究

菌株細胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)觀察：將光合細菌菌液離心，去上清液，用2.5%戊二醛固定后進行超薄切片，采用透視電鏡觀察菌株的細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)[4]。

16S rDNA提?。喊凑誒MEGA Bacterial DNA Kit試劑盒說明書進行，將提取得到的DNA質(zhì)粒，送至上海派森諾生物科技股份有限公司進行測序。得到基因序列后，用ChromasPro編輯序列并與NCBI數(shù)據(jù)庫比較，利用BLAST搜索引擎在GenBank中找出相似程度比較高的典型菌株，利用MEGA-X軟件中多序列對比，畫出用最大似然（Maximum Like-Lihood）法和貝勒斯推論（Bayesian inference）法下的系統(tǒng)發(fā)育樹，并用Bootstrap進行統(tǒng)計檢驗。

碳源利用試驗：分別用16 mmol/L的DL蘋果酸、乙酸鈉、丙酸鈉、丙酮酸鈉（以鈉鹽計算）替代RCVBN培養(yǎng)基中的碳源。28 ℃、光照強度3 000 lx的條件下厭氧培養(yǎng)5 d后，以空白樣為對照組，測定OD660，比較菌株對碳源利用情況。

特征吸收波峰試驗：從光合細菌種子液取2 mL菌液，在室溫的條件下8 000 r/min離心10 min，倒掉上清液，用無菌水洗滌，然后再離心，重復(fù)3次后，加入無菌水稀釋，用紫外可見光分光光度計在230～910 nm進行掃描，記錄出現(xiàn)的波峰[5]。

1.2.4?碳源對菌株去除無機氮效果的影響

將海水晶溶解在蒸餾水中配制成鹽度為30‰的人工海水，將pH預(yù)調(diào)至8.5±0.5，將其裝入5 L燒杯中滅菌，用加熱棒控制水體的溫度為28±1 ℃。

碳源濃度對光合細菌菌株氨氮去除效果的影響：設(shè)置初始氨氮濃度約280 mg/L（20 mmol/L），投加乙酸鈉（AR）濃度分別為40、32、24、16、8、4 mmol/L。

碳源濃度對光合細菌菌株亞硝酸鹽氮氮去除效果的影響：設(shè)置初始亞硝酸鹽氮的濃度約為84 mg/L（6 mmol/L），投加乙酸鈉（AR）濃度分別為72、48、24、16、8和4 mmol/L。

碳源濃度對光合細菌菌株硝酸鹽氮氮去除效果的影響：設(shè)置初始硝酸鹽氮濃度約為112 mg/L（8 mmol/L），投加乙酸鈉（AR）濃度分別為8、4、2、1、0.5 mmol/L。

三種無機氮共存條件光合細菌菌株的去除效果：設(shè)置初始氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮濃度分別為6、6、10 mmol/L，投加碳源濃度為8 mmol/L。

1.2.5?三種無機氮檢測方法?氨氮采用納氏試劑分光光度法[6];亞硝酸鹽氮采用改良的重氮-偶聯(lián)法[7];硝酸鹽氮采用紫外分光光度法[6]。

2?結(jié)果與討論

2.1?菌株的分離純化及鑒定

2.1.1?菌株的菌落與細胞形態(tài)?通過在RCVBN固體培養(yǎng)基上涂布和劃線，在光照強度3 000 lx、溫度30 ℃厭氧的條件下，純化、分離得到一株光合細菌，編號為SQD.C08。RCVBN培養(yǎng)基呈紅色針尖狀大小，邊緣濕潤、有光澤，革蘭氏陰性菌。在3 000 lx、25～30 ℃的環(huán)境下厭氧培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基最終變?yōu)樯罴t色，待菌體老化后，菌液中產(chǎn)生紅色絮狀沉淀。

2.1.2?菌株的形態(tài)特征?菌株的透射電鏡照片如圖1所示，菌株大小為（1.2～2.7）×（0.6～1）μm。表1為與菌株SQD.C08基因類型相近的同屬細菌的形態(tài)特征，由表可知絕大多數(shù)Ectothiorhodospira屬細菌，層狀光合膜有序地堆疊在一起[8]，而不像Ectothiorhodospira magna是呈長鏈薄膜分布在整個細胞中[4]，光合膜體積約占細胞內(nèi)體積的60%～70%。在生長后期，大多數(shù)細胞都會產(chǎn)生氣泡，但由于氣泡在細胞中所占比例不大，所以該菌種的絕大多數(shù)細菌會沉在試管的底部，而不像E.variabilis[9]的絕大多數(shù)細胞一樣浮在試管的上方。在細胞質(zhì)小顆粒的圓形內(nèi)含物可能是聚磷酸鹽，淺色的內(nèi)含物可能是聚β羥基丁酸酯。

菌株的菌液在505 nm、590 nm、805 nm以及855 nm處具有吸收波峰。依據(jù)表2數(shù)據(jù)可知，該光合細菌含有類胡蘿卜素和菌綠素a。根據(jù)圖2的波峰高度可以判斷，菌株積累類胡蘿卜素的能力較弱，積累菌綠素a的能力較強。

2.2?光合細菌菌種16S rDNA鑒定結(jié)果

菌株的16S rDNA的序列長度為1 402 bp，具體序列為：

將菌株的16S rDNA的結(jié)果與其相似度最高的典型菌株用最大似然法和貝葉斯推論法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖3。從圖中可以看出，與菌株親緣關(guān)系最近的物種是E.magna，而者之間的相似度為99%，而相關(guān)節(jié)點的自展支持值和貝勒斯都達到最大值，因此菌株初步鑒定為E. magna。

2.3?光合細菌菌株對不同碳源的利用情況

光合細菌菌株SQD.C08對不同碳源的利用情況見圖4，可以看出光合細菌菌株SQD.C08對檸檬酸鈉、丙酸鈉、丙酮酸鈉、乙酸鈉均能進行較好的利用，其中生長最好的是丙酮酸鈉，其次是乙酸鈉，對蘋果酸鈉利用較差。

2.4?光合細菌菌株對無機氮的去除效果

在不同乙酸鈉濃度條件下，光合細菌菌株對氨氮的去除效果見圖5，從圖中可以看出，實驗過程中實驗組和空白組氨氮均呈下降趨勢，但去除效果存在差異。當初始碳源投加量大于16 mmol/L即C/N比大于0.8時，菌株SQD. C08對氨氮的去除能力比較明顯;當碳源濃度為40 mmol/L即C/N比為2時，氨氮的去除率最高，達到81.8%。當初始碳源投加濃度大于32 mmol/L即C/N大于1.6時，盡管投加碳源濃度升高，氨氮去除率基本無變化，可以推測32 mmol/L的碳源濃度可能是最經(jīng)濟的碳源濃度;投加碳源濃度低于16 mmol/L時，氨氮去除效果基本與空白組一致。在不外加碳源的條件下，菌株SQD.C08對氨氮的去除率為35.6%。

圖6為不同乙酸鈉濃度條件下，光合細菌菌株對亞硝酸鹽氮的去除效果。在實驗過程中，實驗組和空白組中的亞硝酸鹽氮均有下降，與碳源濃度存在明顯關(guān)系。當水體中碳源濃度不低于48 mmol/L時，菌株對亞硝酸鹽氮的去除效果較為明顯，水體中碳源濃度為72 mmol/L時，亞硝酸鹽氮的去除率最高，為46.2%。當碳源濃度低于48 mmol/L時，雖然菌株對亞硝酸鹽氮的去除能力與水體中外加碳源濃度成正比，但各實驗組的去除率差異很小。在空白組中，菌株對亞硝酸鹽氮的去除率僅為7.2%。

不同碳源濃度條件下，光合細菌菌株對硝酸鹽氮的去除效果見圖7?？芍暝谌斯ずＫ袑ο跛猁}氮的去除效果與碳源濃度存在著明顯關(guān)系?？瞻捉M水體的硝酸鹽氮濃度基本不變，但實驗組當中的硝酸鹽氮均有明顯的下降。在2 mmol/L的碳源濃度的實驗組中，菌株對硝酸鹽氮的去除效果最好，去除率為89.7%，且再增加碳源濃度菌株對硝酸鹽氮去除影響不大。相比于氨氮和亞硝酸鹽氮的去除過程，只需投加少量碳源，菌株對硝酸鹽氮就有明顯的去除效果。但不投加碳源時，菌株對水體中的硝酸鹽氮基本沒有去除能力。

在氨氮、亞硝酸鹽和硝酸鹽共存條件下，光合細菌菌株對無機氮的去除情況見圖8。可以看出，在水體中三者共存的條件下，菌株優(yōu)先去除氨氮，對氨氮的去除率最終達到86.87%。在前5 d水體中亞硝酸鹽氮的濃度明顯升高，說明菌株首先將氨氮轉(zhuǎn)化成了亞硝酸鹽氮，同時水體中硝酸鹽氮的濃度下降，說明菌株能直接去除硝酸鹽氮。水體5 d后水體中氨氮含量略有升高，是由于菌株生長代謝所產(chǎn)生的，加之水體中碳源所剩無幾，導(dǎo)致菌株去除氨氮的能力下降，使水體中的氨氮濃度上升，水體中的亞硝酸鹽氮明顯下降而硝酸鹽氮含量的升高，說明菌株將水體中的亞硝酸鹽氮轉(zhuǎn)化成了硝酸鹽氮。

在只含氨氮的條件下，菌株對氨氮的去除能力和水體中有三種無機氮條件下對氨氮的去除能力進行比較得知。菌株在都含有三種無機氮的水體環(huán)境中去除氨氮的能力沒有降低，甚至還略有提高。

3?結(jié)論

從海水底泥中分離出來一株光合細菌，編號為SQD.C08。經(jīng)過菌株形態(tài)、生理生化、菌液吸收波峰及16S rDNA鑒定菌株SQD.C08為Ectothiorhodospira magna。

菌株在人工海水中對氨氮、亞硝酸鹽氮、硝酸鹽氮的去除率分別達到81.83%、46.21%、86.79%;菌株需要投加較多的碳源才能對亞硝酸鹽氮有明顯的去除效果，而只需投加較少的碳源就能對硝酸鹽氮有明顯的去除效果。

在氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮共存的水體中，菌株會優(yōu)先去除水體中的氨氮。菌株去除的氨氮，只有一部分轉(zhuǎn)化成為亞硝酸鹽氮，很大一部分被自身同化。菌株在去除亞硝酸鹽氮的時候會將其轉(zhuǎn)化成為硝酸鹽氮。

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