余新玲

摘 要：隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，熒光定量PCR不僅實(shí)現(xiàn)了從定性到定量的飛躍，且同常規(guī)PCR相比，能夠在同一溶液當(dāng)中實(shí)現(xiàn)不同反應(yīng)，且無須后處理，具有靈敏度高以及特異性強(qiáng)的特點(diǎn)。熒光定量PCR 技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR 從定性到定量檢測的飛躍，實(shí)現(xiàn)了對DNA/RNA 模板的定量，而且與常規(guī)的PCR 相比，所有反應(yīng)均在同一溶液中進(jìn)行，不需任何后處理，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、有效解決PCR污染問題、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、定量結(jié)果準(zhǔn)確和重現(xiàn)性好等特點(diǎn)。目前，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域，特別是近幾年來在動(dòng)物疫病的診斷中得到了廣泛的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：實(shí)時(shí)熒光定量PCR;動(dòng)物疫病;診斷

近年來，隨著實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)日趨成熟，多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR （MFQ-PCR）技術(shù)也得到進(jìn)一步發(fā)展。多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，即在同一個(gè)反應(yīng)體系中，同時(shí)加入多對引物以及相應(yīng)的不同熒光分子標(biāo)記的探針或者熒光染料，一次反應(yīng)對多個(gè)靶基因進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測，大大提高了檢測效率，這一技術(shù)優(yōu)勢使之在臨床多種病原體混合感染的篩查上具有廣闊的前景。近幾年來實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，特別是多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)在動(dòng)物疫病的診斷中也得到了越來越廣泛的應(yīng)用。

一、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在動(dòng)物疫病診斷

近年來， 隨著養(yǎng)牛業(yè)迅速發(fā)展，尤其奶牛飼養(yǎng)數(shù)量不斷增多、國際貿(mào)易頻繁、牛群流動(dòng)廣泛、疫病監(jiān)測和控制不力等眾多因素， 使得牛疫病尤其病毒性傳染病舊病未除，新病不斷出現(xiàn)和流行。

1.禽流感病毒檢測。目前，禽流感已經(jīng)在世界范圍內(nèi)分布，大部分都為隱性感染，沒有特殊臨床表現(xiàn)，僅僅有少數(shù)類型具有高致病以及傳播迅速的特征。由于該病毒具有較為頻繁的變異特征，且具有較多的血清類型，在國外，以往經(jīng)常以雞胚病毒分離方式進(jìn)行病毒檢測，不僅檢測時(shí)間較長，且檢測血清類型較多。目前，我國已有學(xué)者根據(jù)病毒型開發(fā)設(shè)計(jì)出具有特異、敏感特征的引物探針，建立出能夠?qū)崿F(xiàn)A型病毒的熒光PCR。

2.新城疫病毒檢測。該病毒根據(jù)其致病能力的不同可以分為弱毒、中等毒以及強(qiáng)毒力型。在以往診斷中，同樣需要以雞胚病毒分離方式進(jìn)行檢測，所需時(shí)間相對較長。在我國建立的熒光PCR法不僅能夠?qū)⑷跣鲁且卟《就袕?qiáng)毒力的新城疫病毒進(jìn)行區(qū)分，且不會(huì)同常見病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，即具有較高的敏感性。通過SYBR技術(shù)對新城疫病毒在定量以及定性方面分別開展分析，最終通過融解曲線實(shí)現(xiàn)PCR的定性分析。通過熒光PCR在新城疫病毒檢測當(dāng)中的應(yīng)用，不僅能夠獲得同雞胚分離一致的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且能夠證明該方式具有快速、安全、敏感以及特異性特點(diǎn)。

3.鴨乙肝病毒檢測。通過SYBR PCR技術(shù)的應(yīng)用對鴨乙肝病毒進(jìn)行檢驗(yàn)，經(jīng)過檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)是對DHBV進(jìn)行檢測的新方式，具有敏感、特異以及簡便的特征。對鴨乙肝病毒核酸PCR技術(shù)進(jìn)行了建立，并將其應(yīng)用在鴨血清病毒核酸監(jiān)測當(dāng)中，在實(shí)現(xiàn)目標(biāo)體內(nèi)復(fù)制情況分析的基礎(chǔ)上為鴨肝炎病毒在評(píng)價(jià)、發(fā)病機(jī)理以及抗病毒療效預(yù)測方面提供了重要依據(jù)。

4.豬瘟病毒檢測。目前，現(xiàn)有的常規(guī)方式很難對帶毒豬、隱性感染豬以及弱毒免疫豬進(jìn)行區(qū)分。在豬瘟病毒弱毒疫苗5端非編碼區(qū)對一條熒光探針以及引物進(jìn)行了設(shè)計(jì)，在同LC監(jiān)測系統(tǒng)相結(jié)合的基礎(chǔ)上對豬瘟兔化弱毒疫苗的監(jiān)測方式進(jìn)行了建立，不僅具有較高的靈敏度，且檢測耗時(shí)較短，僅僅需要4h。而溫國元等，則將5端非編碼區(qū)作為擴(kuò)增靶區(qū)進(jìn)行試驗(yàn)，對Tapman探針以及兩條引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了熒光PCR檢測方式的建立。該方式靈敏度更高，可以達(dá)到10拷貝/μl，具有較好的應(yīng)用效果。

5.偽狂犬病毒。口蹄疫是一種對偶蹄動(dòng)物具有強(qiáng)烈傳染性的疾病，危害非常大，根據(jù)聚合酶3D基因片段以保守區(qū)域方式實(shí)現(xiàn)探針以及引物的設(shè)計(jì)，在擴(kuò)增區(qū)當(dāng)中，口蹄疫病毒A、C、O型序列相同，在將探針同引物共同應(yīng)用的情況下實(shí)現(xiàn)熒光PCR方式的建立，建立的熒光PCR技術(shù)，則對傳統(tǒng)技術(shù)中病毒鑒定準(zhǔn)確性差、敏感性差以及用時(shí)較長的缺點(diǎn)進(jìn)行了克服，在對環(huán)境污染、病毒擴(kuò)散缺點(diǎn)積極避免的基礎(chǔ)上應(yīng)用在大批量樣品檢測當(dāng)中。

6.炭疽芽孢桿菌檢測。Makino等通過炭疽特異性引物實(shí)現(xiàn)EQ PCR檢測，在該方式中，能夠有效地實(shí)現(xiàn)空氣中細(xì)菌芽孢的檢測。通過熒光PCR技術(shù)的應(yīng)用，在pXI1質(zhì)粒上pag基因?qū)崿F(xiàn)基因探針以及引物的設(shè)計(jì)，對具有定性、快速、定量以及準(zhǔn)確特征的炭疽芽孢桿菌檢測方式進(jìn)行了建立，在pXO1上pag基因以及pXO2上cap基因作為特異引物，在以DNA進(jìn)行嵌入之后實(shí)現(xiàn)定量擴(kuò)增，并在PCR后實(shí)現(xiàn)曲線分析，以此觀察產(chǎn)物是否為之前設(shè)定的目的產(chǎn)物。在將該方式應(yīng)用在炭疽芽孢桿菌檢測后，靈敏度在1000拷貝以上。

7.胸膜肺炎放線桿菌檢測。根據(jù)apx IV A基因序列對相應(yīng)探針以及引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)熒光PCR技術(shù)的建立并將其投入應(yīng)用。經(jīng)過試驗(yàn)操作，在150份樣品當(dāng)中檢測出23份APP陽性的樣品。

8.寄生蟲病。寄生蟲病方面，通過PCR技術(shù)的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)感染弓蟲血液蟲體的觀察，弓形蟲529bp傳入大腸桿菌方式實(shí)現(xiàn)重組質(zhì)粒的構(gòu)建，在將其作為模板的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)熒光PCR標(biāo)曲建立，對具有特異、快速以及靈敏特征的PCR方式進(jìn)行了建立。此外，近年來也具有毛圓線蟲、立克次氏體以及小隱孢子蟲的相關(guān)檢測報(bào)道。

現(xiàn)有各項(xiàng)實(shí)時(shí)熒光PCR 方法均表明，實(shí)時(shí)熒光PCR 具有實(shí)時(shí)、靈敏、快速、精確等優(yōu)點(diǎn)，使其具有較廣闊的研究前景。但染料、探針的選取、設(shè)計(jì)、和價(jià)格昂貴又限制了實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)的推廣。在未來的研究過程中，一方面要試圖找到理想的熒光染色劑，另一方面應(yīng)當(dāng)著手進(jìn)行各類主要疫病的實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測方法的建立，為臨床檢測提供快速、可行、可靠、實(shí)際的檢測方法。實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)將會(huì)在動(dòng)物疫病診斷中得到更加廣泛的應(yīng)用。

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