王金燦，王春淼，趙 晴，馮麗肖，石林春，劉金欣、△

(1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所/河北省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北承德 067000；2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所）

金蓮花為毛茛科植物金蓮花Trollius chinensisBunge.的干燥花，味苦、微寒，主治上呼吸道感染[1]。在我國金蓮花有16種，分布于河北、山西等地，其中以河北省承德壩上所產(chǎn)的金蓮花藥材最佳[2]。金蓮花的藥用價(jià)值較高，但其野生資源不足，難以滿足市場(chǎng)需求，需要大規(guī)模人工種植。而種子是中藥材種植的源頭，因此保障金蓮花種子的真?zhèn)尉惋@得尤其重要。由于金蓮花種子的形態(tài)學(xué)特征不明顯，無法使用傳統(tǒng)的方法來判斷金蓮花種子的真?zhèn)?。DNA條形碼分子鑒定技術(shù)是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對(duì)較短的DNA序列，來進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)幾乎不受環(huán)境、被鑒定物形態(tài)等情況的影響，可以很好彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法的不足[3-5]。DNA條形碼分子鑒定技術(shù)已經(jīng)成功鑒定了桔梗[6]、黃芩[7]、知母[8]等中藥材的種子，但對(duì)金蓮花種子的鑒定尚未有研究。本研究以金蓮花種子為研究對(duì)象，采用DNA條形碼技術(shù)對(duì)金蓮花種子的基原進(jìn)行了鑒定，以期為鑒別金蓮花種子的真?zhèn)翁峁┮罁?jù)。

1 儀器與材料

MM400型球磨儀（德國Retsch公司），1-14型離心機(jī)（德國Sigma公司），NanoDrop 2000c型超微量分光光度計(jì)（美國Thermo Fisher Scientific公司），天根植物DNA提取試劑盒（天根生化科技(北京)有限公司），PCR Master Mix試劑（北京艾德萊生物科技有限公司)。

來自金蓮花道地產(chǎn)區(qū)河北省承德市和內(nèi)蒙古自治區(qū)的金蓮花種子9份，見表1：

表1 金蓮花種子樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 DNA提取，PCR擴(kuò)增和測(cè)序 從收集到的9份不同產(chǎn)地的金蓮花種子樣品中，每份樣品選取3粒籽粒飽滿的種子，分別進(jìn)行編號(hào)（共27個(gè)實(shí)驗(yàn)編號(hào)）并使用天根植物DNA提取試劑盒提取單粒種子的DNA，提取操作步驟參照試劑盒說明書進(jìn)行，使用超微量分光光度計(jì)鑒定金蓮花種子DNA的質(zhì)量。參照《中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則》擴(kuò)增ITS2序列，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，使用測(cè)序儀進(jìn)行雙向測(cè)序，并參照《中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則》判斷測(cè)序峰圖質(zhì)量。

結(jié)果顯示27個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品的DNA濃度平均值為26.2g/μl，DNA的A260/A280位于1.8～2.0之間，A260/A230的平均值約為1.18，說明所提取的DNA純度較高。采用瓊脂糖凝膠電泳法和凝膠成像法檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，所得電泳見圖1，在480bp的位置上有明顯條帶。雙向測(cè)序所得測(cè)序峰圖分離程度高，無重疊峰出現(xiàn)，可進(jìn)行序列拼接獲取ITS2序列。

圖1 瓊脂糖凝膠成像電泳圖譜

2.2 序列比對(duì)、NJ系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建和BLAST分析 利用Muscle 3.8軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，用中藥材DNA條形碼鑒定系統(tǒng)（http：//www.tcmbarcode.cn）進(jìn)行BLAST鑒定分析，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，使用BLAST法和NJ系統(tǒng)發(fā)育樹法進(jìn)行物種鑒定。

9份金蓮花種子樣品，每份樣品選取3粒，共獲得27條ITS2序列，相關(guān)序列已提交至NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）?；诮⒌慕鹕徎↖TS2條形碼數(shù)據(jù)庫，分別使用NJ系統(tǒng)發(fā)育樹法和BLAST方法進(jìn)行基原物種鑒定。由NJ系統(tǒng)發(fā)育樹可知，所有樣品分為兩支，JLHZ03（Z31、Z32、Z33）和JLHZ04（Z41、Z42、Z43）單獨(dú)聚為一支，與其它樣品區(qū)分明確（圖2）；經(jīng)BLAST比對(duì)后可鑒定出JLHZ03和JLHZ04為播娘蒿，其余序列可鑒定為金蓮花。

圖2 金蓮花種子樣品NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

本研究結(jié)果顯示除JLHZ03和JLHZ04兩份樣品為播娘蒿外，其余7份金蓮花種子均為正品。金蓮花可清熱解毒，主治上呼吸道感染、扁桃體炎等疾病，其中以治療上呼吸道感染最為有效，具有較高的醫(yī)用價(jià)值[1]。然而，金蓮花在自然狀態(tài)下根的再生能力差，僅靠種子繁殖，但其種子常隨著藥用部位—花的被采摘使用而遺失，因此造成了種質(zhì)資源的流失[9]，而金蓮花的這種特點(diǎn)導(dǎo)致目前市場(chǎng)上金蓮花種子的市售價(jià)格較高（平均900元/斤）。播娘蒿在除華南外全國各地均可生產(chǎn)，資源充足，因此其種子的市售價(jià)格遠(yuǎn)低于金蓮花種子，且與金蓮花種子外觀形態(tài)相似，難以通過形態(tài)特征進(jìn)行區(qū)分，部分商家為了追逐利益在金蓮花種子中混入了播娘蒿種子。根據(jù)2015版《中國藥典》[10]記載，播娘蒿以種子入藥，藥材名為葶藶子，葶藶子可以瀉肺平喘、行水消腫，與金蓮花的功效截然不同。在金蓮花種子中混入播娘蒿種子不僅會(huì)給農(nóng)戶造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還會(huì)增加臨床安全用藥的風(fēng)險(xiǎn)。

然而，金蓮花種子的形態(tài)學(xué)特征不明顯，無明顯的種臍等特征，傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法在鑒定金蓮花種子上存在一定的局限性，因此亟需一種新的手段來鑒定金蓮花種子。DNA條形碼分子鑒定技術(shù)顯著推動(dòng)了分類學(xué)的發(fā)展[11-12]，同時(shí)中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則已經(jīng)成功納入2015年版《中國藥典》[13]，中藥材DNA條形碼分子鑒定技術(shù)也已經(jīng)深入到中藥材生產(chǎn)的源頭-中藥材種子的鑒定研究[6]。本研究以市售金蓮花種子為研究對(duì)象，基于ITS2序列對(duì)其基原進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示ITS2序列可以用于鑒定金蓮花種子。因此，本研究可為在源頭上保證金蓮花物種子的真?zhèn)翁峁┮罁?jù)。